绵羊ELOVL5基因的生物信息学分析

极长链脂肪酸延伸酶蛋白家族(elongation of very-long-chain fatty acids, ELOVLs)是一类催化脂肪酸合成的限速酶,主要调控血脂、血糖及一些代谢疾病的发生。为探究绵羊ELOVL5基因的结构和功能,本研究对该基因及其编码产物进行了生物信息学分析。结果显示,绵羊 ELOVL5 基因编码737个氨基酸,其编码蛋白分子式为C1656H2448N416O415S16,其分子质量为35 335.39 Daltions,理论等电点为9.47,估计半衰期为30 h,不稳定性指数为33.35。亚细胞定位主要位于内质网中(55.6%),ELOVL5基因编码蛋白没有信号肽序列,不属于分泌蛋白。该蛋白存在多个跨膜区域,属于跨膜蛋白,存在7个保守结构域,并且为亲水性蛋白,二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,三级结构主要由α螺旋缠绕折叠而成。     

甜高粱SUT1基因克隆、表达及生物信息学分析

为获知甜高粱蔗糖转运蛋白基因SUT1及其功能,采用同源克隆方法结合RACE技术克隆甜高粱SUT1基因,并对其进行生物信息学分析。克隆得到甜高粱蔗糖转运蛋白基因SUT1 c DNA全长为2 472bp,包括1 560bp编码区序列,编码含有519个氨基酸的蛋白。该蛋白是1个疏水性膜蛋白,分子量约为55k Da,理论等电点p I为8.86;无信号肽剪切位点,含有12个明显的跨膜螺旋拓扑结构,预测含有6个丝氨酸激酶磷酸化位点、4个苏氨酸激酶磷酸化位点和2个酪氨酸激酶磷酸化位点;包含1段低复杂度序列和12个保守的跨膜螺旋结构域。在亚细胞水平,SUT1主要定位于叶绿体类囊体膜、质膜、高尔基体及内质网膜上;二级结构主要以α-螺旋为主,其中α-螺旋占43.35%,无规则卷曲占34.68%,延伸链占19.08%,β-转角占2.89%;预测SUT1蛋白主要在运载结合中发挥重要作用。SUT1基因表达分析结果表明,SUT1基因在各组织中均有表达,叶中表达量最高,其次分别为叶鞘、茎和根,穗中表达量最低。SUT1基因的克隆及其结构、性质与功能的初步分析,可为研究该基因在甜高粱源库互作关系中的功能机制奠定基础。     

拟南芥Nodulin MtN21家族At1g0938基因功能的初步研究

拟南芥Nodulin MtN21 蛋白家族含有1～2个DUF6结构域,具有内在膜蛋白的特性。推测该家族基因在小分子跨膜运输、信号转导和抗逆性等方面发挥作用。At1g09380是拟南芥Nodulin MtN21 基因家族成员。本研究通过PCR筛选获得At1g09380对应的T-DNA 插入纯合子,并通过RT-PCR鉴定该突变体为无效突变体。对突变体萌发和萌发后阶段进行盐胁迫和干旱胁迫分析,结果表明,At1 g09380 突变体萌发后对NaCl和干旱胁迫敏感,证明该基因参与拟南芥的盐和干旱胁迫响应过程。同时还发现在长日照条件下突变体植株比野生型植株早开花7d左右。以上研究结果为进一步分析该基因的生物学功能打下基础。     

盐碱胁迫下野生大豆CBL-CIPK通路表达分析

野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆(Glycine max)的近缘野生种,含有栽培大豆中不存在的优异基因。为了明确类钙调磷酸酶B蛋白(CBL)与其互作蛋白激酶(CIPKS)组成的CBL-CIPK通路蛋白在野生大豆抗盐碱胁迫中的功能,本研究在盐碱胁迫下高耐及敏感野生大豆材料转录组分析的基础上,利用在线生物学工具对野生大豆CBL-CIPK通路蛋白结构、亚细胞定位、磷酸化位点及系统发育进行了分析。结果发现,10个野生大豆CBLs蛋白均含有3个EF手结构;7个CBLs蛋白定位于细胞核,另外3个分别定位于细胞质、叶绿体和内膜系统。38个CIPKs蛋白均含有ATP结合结构域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性结构域和NAF结构域;20个CIPKs蛋白定位在细胞质中,9个定位在叶绿体中,6个定位在细胞核中,另有3个分别位于细胞器膜、线粒体和内膜系统。野生大豆与栽培大豆的CBL-CIPK通路基因高度同源,但野生大豆GsCIPK5_like基因与栽培大豆GmCIPK5亲缘关系较远,栽培大豆GmCIPK21基因与野生大豆GsCIPK21亲缘关系较远。在盐碱胁迫处理0和10 h后,GsCBL10基因在高耐材料中的表达量比敏感材料显著上调;在盐碱胁迫处理0 h后,GsCIPK10基因在高耐材料中的表达量也比敏感材料显著上调。本研究为阐明CBL-CIPK通路对野生大豆耐盐碱胁迫中的功能奠定了理论基础。     

白菜类富含亮氨酸重复（LRR）抗病蛋白基因BcLRR cDNA克隆及其介导的植物软腐病抗性分析

利用前期构建的软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株BC1侵染诱导表达的大白莱(Brassica campestris subsp.pekinensis)SSH cDNA文库和cDNA芯片.在芯片分析的基础上,选取一个与拟南芥(Arabidopsis thaliana)类富含亮氨酸重复(LRR)抗病蛋白Cf-5高度同源的EST序列(GenBank登录号:DN962361)进行进一步分析.用5'-和3'-RACE方法克隆了该基因全长1 286 bp的cDNA序列,包含一个完整ORF和3'UTR,并具有Poly(A)加尾信号,将其命名为BcLRR基因(GenBank登录号:EU424347).BcLRR推导蛋白序列由327个氨基酸组成,除N端跨膜螺旋结构域外,大部分为LRR结构域,包含8个胞外LRR重复单元,由7个规范的LXXLXLXN结构和1个不规范LXXLXXXN组成.氨基酸序列比对分析发现,BeLRR蛋白与拟南芥类LRR抗病蛋白Cf-5同源性高达96.6%,与棉花(Gossypium hirsutum L.)类LRR抗病蛋白GhLRR同源性为82.3%,它们之间大部分变异限定在N端信号肽区.系统发育关系表明,在三种植物中功能均未知的这一蛋白属于一个新的胞外LRR蛋白类型,在结构上不同于其它抗性已知的胞外型LRR蛋白.将受CaMV 35S启动子驱动的BcLRR基因完整ORF序列转化拟南芥Col-0,PCR鉴定、Southern杂交和RT-PCR分析表明,BcLRR基因已整合到拟南芥基因组中,并在拟南芥中获得了转录.软腐病病情指数分析表明,转BcLRR植株提高了对软腐欧文氏菌的抗性.     

苹果甘露糖结合蛋白2基因(MdMBP2)的克隆及其重组蛋白的活性研究

甘露糖结合蛋白(MBP)是一类包含B-lectin结构域的植物凝集素,通过与糖的结合参与多种生理过程,包括细胞和细胞之间的相互作用以及寄主和病原之间的相互作用等.为了探讨苹果甘露糖结合蛋白在抗轮纹病防御反应中的作用,本研究从苹果(Malus demestica)枝条韧皮部cDNA鉴定了一个甘露糖结合蛋白的编码基因,命名为MdMBP2(GenBank accession No.JX126857).该基因全长1 553 bp,开放阅读框为1 368 bp,编码一个由455个氨基酸残基组成的蛋白质,分子量和等电点分别为50.4 kD和8.68.该蛋白的氨基酸序列包含保守的B-lectin结构域,N端有27个氨基酸残基组成的信号肽,C端有一个PAN-apple结构域.同源性和系统演化分析显示,MdMBP2蛋白与葡萄(Vitis vinifera)和大豆(Glycinemax)的表皮分泌蛋白(EP)及拟南芥(Arab idopsis thaliana)的甘露糖结合蛋白具有较高的序列相似性.包含B-lectin结构域的蛋白可以分成两个群,MdMBP2属于Class Ⅰ,与ClassⅡ蛋白相比,Class Ⅰ缺少SLP结构域和蛋白激酶结构域.利用荧光定量PCR技术检测MdMBP2基因的表达,发现MdMBP2基因在被检测的几种组织中均有不同程度的表达,但在皮和叶中的表达量较高,这种表达模式表明,MdMBP2可能参与多种生理途径.另外,轮纹病病原菌(Botryosphaeria dothidea)侵染能诱导MdMBP2转录本的积累,且其时序表达变化与轮纹病发病过程相关,暗示该基因参与了苹果抗轮纹病的防御反应.通过体外重组表达MdMBP2基因的重组蛋白,并用重组蛋白进行糖结合实验,发现MdMBP2蛋白能与真菌细胞壁组分高甘露糖型聚糖和甘露寡糖有较高的结合活性,表明MdMBP2蛋白可能参与病原真菌的识别.本研究分离鉴定了一个新的苹果甘露糖结合蛋白的编码基因,认为该基因参与苹果对轮纹病病原的防御反应,可能在寄主对病原的识别过程中发挥作用.     

嗜水气单胞菌粘附素和外膜蛋白A基因克隆与结构预测

采用PCR方法扩增嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）外膜蛋白相关基因,即粘附素（Aha）、外膜蛋白A（OmpA）基因全长序列,进行DNA测序及生物信息学分析。结果表明：Aha基因长1 314 bp,推导编码355 aa,5～24 aa区域为跨膜螺旋,26～355 aa区域为革兰氏阴性菌孔蛋白结构域（PF00267）,Aha蛋白三级结构与模板（PDB：1PHO_A）相似性达28.21%;OmpA基因长1 102 bp,推导编码338 aa,含有OmpA跨膜结构域（PF01389）和OmpA结构域（PF00691）,预测OmpA蛋白抗原表位位于64～69 aa、160～171 aa、244～249 aa、259～274 aa和295～301 aa区域,OmpA蛋白三级结构OmpA跨膜结构域和OmpA结构域与模板（PDB：1BXW_A,PDB：4ERH_A）相似性分别为27.45%和57.58%;进一步采用拉马钱德兰图（Ramachandran plot）检测分析,与Aha、OmpA基因蛋白三级结构预测结果一致。本研究有助于理解嗜水气单胞菌致病的分子机制,为鱼类疾病防治及疫苗应用提供科学参考。     

莲藕多酚氧化酶基因(PPO)的克隆与表达分析

为获得莲藕中多酚氧化酶(Ppo)基因序列信息及其表达情况,运用PACE技术从莲藕(Nelumbonucifera Gaertn.ssp.nucifera)茎尖中克隆到多酚氧化酶基因全长序列,其cDNA全长2 074 bp,完整的编码框为1 503 bp,编码501个氨基酸,5’端有160 bp非编码区,3’端有411bp非编码区(GenBank登陆号为HQ380894).采用生物信息学方法发现该蛋白分子量约为56.8 kD,pI为8.60,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白,a-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中.半定量RT-PCR结果显示,该基因在莲藕茎尖、幼叶、莲藕鲜切片、花瓣、茎杆5种组织中均有表达.方差分析表明,茎尖中PPO表达量与幼叶差异不显著,但显著高于其余三个部位;幼叶中表达量与莲藕鲜切片之间差异不显著,但显著高于花瓣和茎杆;花瓣和茎杆中PPO表达量最低,两者无显著差异.上述结果说明作为重要分生组织的莲藕茎尖产生的PPO可能不具活性或极不稳定,随着植株的生长发育被分配到各组织中,在特定时空下被激活并担负相应的职责功能.     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中Fsr1基因的克隆及生物信息学分析

以尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种为材料,克隆其Fsr1基因的DNA及cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。根据镰刀菌中相关基因设计简并引物,结合PCR与RT-PCR技术扩增目的片段,进行氨基酸序列推导后分析。得到结果 FoFsr1基因开放阅读框为2 474 bp,共编码824个氨基酸;FoFsr1基因编码蛋白可能是存在于细胞核中的跨膜亲水蛋白,含有54个蛋白磷酸化位点,不含有信号肽;该蛋白主要含有1个Striatin结构域及7个WD40结构域,二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其中不含有亮氨酸拉链结构;同源性分析发现其与丛赤壳菌属中的Fsr1蛋白亲缘关系最近。通过结构分析发现,推测该蛋白可能在细胞周期及细胞凋亡过程中起信号转导与转录调控的作用,从而对病原菌的致病力产生影响。     

盐藻CDPK基因的克隆与生物信息学分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,应用RT-PCR和RACE方法从盐藻Dunaliella salina中克隆得到CDPK基因(GenBank登录号为JQ964113),并对其进行生物信息学分析.结果表明:盐藻CDPK基因的cDNA全长3 052bp.5’-UTR长70bp;开放阅读框长1650bp,编码549个氨基酸;3’-UTR长1 332bp.蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构同源建模成功.亚细胞定位于叶绿体和细胞核中,无跨膜结构域,无信号肽.蛋白序列中存在4个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点,蛋白激酶结构域在53 ～ 331位氨基酸处,蛋白激酶ATP结合域在59 ～82位氨基酸处,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域在173 ～ 185位氨基酸处,4个EF-hand钙结合域分别在357 ～ 385、393 ～ 421、429 ～ 457、465 ～ 493位氨基酸处.进化分析结果表明,克隆的CDPK基因与团藻、衣藻、盐藻Dunaliella tertiolecta的CDPK亲缘关系最近.为进一步研究CDPK基因的功能及探究盐藻耐盐机制的信号转导途径奠定了分子基础.