番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。     

番鸭呼肠孤病毒MW97106C蛋白基因克隆及其在E．coli中表达

应用RT～PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因，序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp．编码269个氨基酸，相对分子量为29．4ku，DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93％的同源性，而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21％～25％之间，表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中．经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，Western—blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应．表明σC基因表达产物具有免疫原性，为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710σC蛋白基因克隆及其在E.coli中表达

应用RT2PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因,序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp,编码269个氨基酸,相对分子量为29.4ku,DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93%的同源性,而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21%～25%之间,表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,Western2blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应,表明σC基因表达产物具有免疫原性,为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为300bp,与预期的目的片段大小一致,经PCR、酶切反应鉴定后克隆到pGEM-Teasy载体中,核苷酸序列经BLAST软件分析表明:番鸭呼肠孤病毒MW9170株S1基因的目的片段与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为91.7%,与鸡关节炎病毒S2基因同源性为68.7%,结果提示番鸭呼肠孤病毒MW9710株与鸡关节炎病毒亲缘距离较远.     

鹅呼肠孤病毒GRV1株分离鉴定及其σC基因特征性分析

从患运动障碍的雏鹅肝脏和脾脏分离到一株鹅源呼肠孤病毒,该病毒经琼脂扩试验可与番鸭呼肠孤病毒(MuscovyDuckReovirus,MDRV)的抗血清发生交叉反应,推测其为呼肠孤病毒,命名为GRV1。参考GenBank禽呼肠孤病毒(AvianReovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒小外壳蛋白(minorcoreprotein)σC蛋白基因序列设计合成了一对引物,病毒RNA经RT-PCR扩增,产物为810bp,与预期的目的片断大小一致,测序结果表明σC基因在280～1089区间是一个开放性阅读框架,编码269个氨基酸的蛋白,GC含量为49.88%,等电点为6.497,分子量为29.4Ku。核苷酸序列经DNAStar(6.0)软件分析,与法国番鸭呼肠孤病毒89026株核苷酸同源率为93.0%,与鸡呼肠孤病毒σC基因同源率仅为21%～25%,同源性分析表明鹅呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤病毒可能来自同一祖先,建议将鹅呼肠孤病毒连同番鸭呼肠孤病毒归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒的独立基因群。由蛋白质分析软件Anthepro5.0和MultiCoil软件分析表明,抗原区多位于N末端,没有跨膜区,σC为三股螺旋结构,这是我国第一次在鹅体内分离到呼肠孤病毒,同时也是第一次在数据库中提供σC的序列。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组（S1-4）中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明：鸭呼肠孤病毒（DRV）与禽呼肠孤病毒（ARV）的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76．0％～77．1％和78．4％～79．6％，氨基酸同源性分别为89．5％～91．2％和91.6％～92．7％；而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60．3％～64．4%和2．7%～9．9％，氨基酸同源性分别为61．4％～62．0％和22．6％～26．7％；DRV和ARV抗原性存在差异。而DRVS12／S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90．0％、93．6％、87．9％～88．0％和93．1%，氨基酸同源性分别为97．1%、94．3%、95．7%～95．9%和93．7％。进化树分析表明，DRV与ARV形成不同的分支，DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC蛋白基因的克隆与序列分析

参考已发表的番鸭呼肠孤病毒(mDRV)的S4序列设计了S4对扩增σC蛋白基N的引物，对mDRV ZJ99株的RNA抽提物进行RT—PCR扩增，获得了特异性的扩增片段。将PCR产物克隆测序，序列经同源性比较，发现mDRV ZJ99株σC蛋白基N序列与福建MW9710株对应基N的同源性为99．5％，与法国89026株对应基因的同源性为94．2％，与法国89330株对应基因的同源性为95．0％；相应的氨基酸序列同源性分别为98．9％、94．1％、93．7％。基于σC基因及其推导氨基酸序列的蛋白质结构及物理化学性质预测结果，与国外学者对mDRV σC蛋白的报道相似。     

番鸭呼肠孤病毒非结构基因的克隆和序列分析

参考GenBank禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒(Muscovy Duck Reovirus,MDRV)非结构基因(NS)序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因进行RT-PCR扩增,克隆到pMD18-T载体中,并对克隆产物进行酶切鉴定和测序;番鸭呼肠孤病毒NS基因由1 291 bp核苷酸组成,与禽呼肠孤病毒NS基因相比,在非编码区第1155位少一个碱基,本文第一次证实1291bp是番鸭呼肠孤病毒NS基因特有的长度;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因的5'末端和3'末端分别为5‘GCTTTT和TCATC-3',是禽类呼肠孤病毒基因末端特有的碱基序列,S14和C4株NS基因的的有效阅读框(24～1127bp)编码367个氨基酸组成的蛋白,分子量约为40kDa;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS蛋白等电点分别是7.3和7.0,GC含量分别为54.26%和53.71%,番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因间核苷酸同源性为99.3%,仅有4个氨基酸差异,S14和C4与法国番鸭呼肠孤病毒89026株NS基因核苷酸同源性分别为87.8%和87.9%,与鸡关节炎病毒S1133 NS基因同源性分别为79.0%和79.3%;进化树分析表明本研究中的两株番鸭呼肠孤病毒非结构基因(NS)与番鸭呼肠孤病毒的亲缘关系比禽呼肠孤病毒近的多,建议番鸭呼肠孤病毒应归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒独立基因群.     

新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因克隆与序列分析

参考GenBank新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus,NDRV）S3基因序列设计合成一对引物,对新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为1 104 bp,与预期的目的片段大小一致.相似性分析QY株S3基因核苷酸序列与ARV代表株、MDRV代表株和DRV代表株,相似性分别59.4％ ～ 60.0％、61.1％～ 61.3％和96.7％～ 98.6％;氨基酸的相似性分别为67.6％～ 68.7％、68.1％～68.9％和95.4％～ 98.4％.表明QY株的S3基因具有不同于ARV和MDRV的特征,分离病毒QY株是不同于禽呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒的独立基因群.     

禽呼肠孤病毒μNS非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)M3基因序列,设计并合成了一对跨越μNS非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV的10个毒株进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果表明,10个毒株μNS蛋白基因ORF的核苷酸序列全长均为1908 bp,编码635个氨基酸。这10个毒株之间的核苷酸及推导的氨基酸同源性分别都在98%以上。将它们与哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)、番鸭呼肠孤病毒(DRV)等进行核苷酸及推导的氨基酸序列比较,并进行遗传系统树分析,结果表明ARV与MRV有较大的差异,与DRV差异较小。     

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒

参考 Gen Bank中番鸭呼肠孤病毒 (m uscovy duck reovirus,MDRV ) S1基因序列 ,用计算机设计并合成了 1对引物 HP11、HP12 ,以此引物用 RT- PCR对番鸭呼肠孤病毒 S1基因进行了特异性扩增。结果表明 :引物 HP11、HP12能从所有供试的 4株分离毒 MDRV- MW9710、MW980 6、MW980 9、MW9810扩增出 30 0 bp S1基因 c DNA片段 ,而不能从禽呼肠孤病毒 (ARV) S1133株和番鸭胚成纤维 (MDEF)细胞培养物中扩增出任何片段 ;该 RT- PCR的检测灵敏度为 1pg的病毒核酸 ,特异性强 ,重复性好 ,对含毒细胞培养液和尿囊液只需用氯仿进行简单处理 ,即能检测出 MDRV核酸。因此认为 ,该 RT- PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒的快速检测     

新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及板蓝根合剂的预防效果评价

本研究对采自山东不同地区的疑似鸭呼肠孤病毒感染病料样品进行了病原的分离与鉴定,成功分离出5株鸭呼肠孤病毒,根据鸭呼肠孤病毒σC蛋白的基因序列,利用RT-PCR技术对分离株进行了鉴定。结果表明,分离株σC基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%～99.6%和94.4%～99.7%,与新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的σC基因的核苷酸同源性为96.9%～98.6%。基于σC基因的遗传进化分析表明5个分离株均符合NDRV的分布特点,且与禽呼肠孤病毒（ARV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的亲缘关系相对较远,均属于新型鸭呼肠孤病毒。进一步对板蓝根合剂的预防效果进行了研究,结果显示,板蓝根合剂药物-攻毒组的发病率显著低于攻毒组。本研究成功分离鉴定出5株NDRV,并发现板蓝根合剂对鸭呼肠孤病毒病具有良好的预防效果,能够有效抵抗NDRV的感染,这为今后新型鸭呼肠孤病毒病的预防提供了新的思路。     

广东新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因克隆及序列分析

为研究广东新型呼肠孤病毒（NDRV）的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白基因进行系统进化比对分析。结果表明,广东省鸭群中感染的NDRV与国内其他地区报道的DRV核苷酸序列同源性很高,达96.6%~99.5%,而与禽呼肠孤病毒（ARV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的同源性则较低,分别为64.6%~66.5%和66.2%~67.1%;8株NDRV之间的核苷酸序列同源性高达97.7%~99.7%。与其他毒株比较结果显示,本试验分离的NDRV毒株磷酸化位点均比参考毒株ARV和MDRV少,且大多数区域的抗原指数都较高,抗原性与MDRV较为接近,遗传进化分析结果表明,NDRV和国内其他DRV处于独立的进化分支,ARV和MDRV则处于不同分支。结果表明,广东省流行的NDRV毒株σB蛋白基因序列高度保守,且广东地区分离的NDRV与国内其他地区分离的DRV没有明显的地域差异。     

广东新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因克隆及序列分析

为研究广东新型呼肠孤病毒(NDRV)的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白基因进行系统进化比对分析。结果表明,广东省鸭群中感染的NDRV与国内其他地区报道的DRV核苷酸序列同源性很高,达96.6%~99.5%,而与禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的同源性则较低,分别为64.6%~66.5%和66.2%~67.1%;8株NDRV之间的核苷酸序列同源性高达97.7%~99.7%。与其他毒株比较结果显示,本试验分离的NDRV毒株磷酸化位点均比参考毒株ARV和MDRV少,且大多数区域的抗原指数都较高,抗原性与MDRV较为接近,遗传进化分析结果表明,NDRV和国内其他DRV处于独立的进化分支,ARV和MDRV则处于不同分支。结果表明,广东省流行的NDRV毒株σB蛋白基因序列高度保守,且广东地区分离的NDRV与国内其他地区分离的DRV没有明显的地域差异。     

免疫鸭群中一株变异型番鸭呼肠孤病毒的分离与特性研究

本研究从广东省某发病番鸭场分离得到的呼肠孤病毒(DRV)混合有番鸭细小病毒(MDPV)疫苗株.采用MDPV阳性血清中和后,经2轮番鸭胚有限稀释克隆获得纯化的DRV.电镜观察病毒粒子呈球形、无囊膜、双层衣壳、直径约70 nm.F6代病毒滴度为log107.5 TCID50/0.1 mL,病毒能够致番鸭胚成纤维细胞产生细胞病变,并能够致死番鸭胚和SPF鸡胚,回归1日龄雏番鸭出现典型的肝脏点状或斑块状出血等特征性病变,与临床发病鸭相同.分离株S3基因核苷酸同源性与太湖流域2011年分离株DRV-TH 11最高,为99.9％,与福建番鸭源分离株MDRV-J 18为98％;与早期MDRV在66.8 ％～67.2％之间,处于不同进化分支上.本研究分离株对番鸭胚、SPF鸡胚及雏番鸭致病力强,而且其基因序列比早期分离株变异较大,应加强监测并及时筛选新疫苗株以有效防控该病的发生和蔓延.     

中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB株S4基因序列分析

应用非免疫番鸭胚增殖中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株,用LSTRIAZOL提取病毒RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株S4基因节段cDNA.将S4cDNA克隆到PMDl8-T载体上,并进行了鉴定和核苷酸序列测定.序列分析结果,克隆的S4cDNA共1 124bp,包括非编码区和完整的阅读框架.分子进化系统分析表明该毒株与禽呼肠孤病毒(鸡呼肠孤病毒)的亲缘关系较远,DRV-YB与DRV-89330同缘率为93.3%.     

番鸭呼肠孤病毒YB株σC蛋白同源性分析及B细胞表位预测

为预测番鸭呼肠孤病毒(DRV)YB株σC蛋白二级结构和B细胞抗原表位,对DRV YB株的σC蛋白氨基酸序列与参考DRV相应序列以DNAStar软件进行同源性和遗传进化树分析;采用SOPMA法、Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schultz法方法预测其二级结构;用Hopp-Woods法、Emini法、Jameson-Wolf法和吴玉章等建立的方法分别预测蛋白的亲水性、表面可能性和抗原指数,然后综合分析其B细胞抗原表位.结果显示,DRV YB与国内DRV相应序列同源性在93.7％～99.6％,代表性较强;B细胞表位可能在15～27、36～49、40～49及90～98区段或其附近,这4个被预测的表位均含有β-转角和无规卷曲结构.本研究为进一步确定σC蛋白的B细胞表位和反向()计提供了理论基础.     

鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析

参考GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法对国内鹅细小病毒分离株H1(GPV-H1)株的结构蛋白VP2基因进行扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明：H1株VP2的核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与GenBarrk发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)FRANCE株、FM株的VP2相比，核苷酸同源率分别为98．6％、96．2％、93．2％、80．3％、80．0％，推导氨基酸序列同源率分别为98．3％、97．5％、96．1％、88．2％、87．4％。     

一株雏鹅呼肠孤病毒的分离与鉴定

2013年福建省某鹅场发生一起以肝脏和脾脏均有灰白坏死点(肝白点)为典型病变特征的急性传染病。本研究利用10日龄非免疫番鸭胚,从病死雏鹅肝脏中分离到1株病毒。病毒分离株没有血凝活性,其ELD50为10-3.25/0.2 m L,可被鹅呼肠孤病毒高免血清特异性中和。利用鹅呼肠孤病毒特异性检测引物对FJ-06株病毒尿囊液进行RT-PCR检测,可扩增到约572 bp特异性目的条带。将RT-PCR产物进行克隆测序,Blast分析表明,克隆的基因片段为鹅呼肠孤病毒δC蛋白基因片段。结果表明成功分离到1株鹅呼肠孤病毒。     

种番鸭呼肠孤病毒的分离及RT-PCR鉴定

从表现为肝、脾表面坏死的240日龄种番鸭组织脏器中分离到1株病毒,暂命名为ZJ-10-06株,参照胡奇林等发表的文献进行RT-PCR[3]初步认定所分离到的毒株为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒。序列分析表明,ZJ-10-06与引起鸭脾坏死症HC/China病毒株同源率最高(95.3%),遗传进化分析可将番鸭呼肠孤病毒分成2个分支,ZJ-10-06和HC/China共处一相对独立小分支。