水稻多逆境响应新基因OsMsr9的表达与克隆

为发掘水稻新的耐逆基因,研究植物在应答逆境胁迫时的分子机制,我们采用Affymetrix水稻表达芯片分析了超级稻两优培九母本培矮64S全基因组在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一批表达水平显著改变的基因。其中基因OsMsr9(Oryza sativa L.Multiple Stresses Responsive Gene9,GenBank登录号为EU276058)的表达量在高温、低温、干旱处理后在多个组织器官、发育时期均有显著提高。实时定量PCR分析其特定时空表达量的结果与基因芯片的结果基本吻合。通过RT-PCR法,得到包含OsMsr9完整ORF(open reading frame)的cDNA克隆。根据生物信息学分析,该ORF编码一个包含168个氨基酸残基的蛋白质,与玉米(Zea mays)中含F-box结构域的全长蛋白有大约58%的相似性,而F-box蛋白可能与植物抗逆性有关。基于上述实验及分析结果,OsMsr9可能是一新的水稻耐逆功能基因。     

水稻多逆境响应基因OsMsr13的克隆与功能分析

为了深入研究作物耐逆境胁迫的分子机制和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix基因芯片技术与水稻表达芯片(含51,279个转录本),分析了培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平变化,筛选出一批耐多逆境候选功能基因.OsMsr13是其中一个受低温、高温与干旱诱导,在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因.根据序列生物信息学分析,OsMsr13含有7个外显子和6个内含子,cDNA全长序列为1603bp,完整的ORF为1317bp,编码一个含438个氨基酸残基的蛋白质;在OsMsr13启动子区域发现多个与逆境应答相关的顺武作用元件;数据库查找和蛋白质多序列的比对表明Os Msr13的预测蛋白属于钙调素结合蛋白家族.为了进一步研究OsMsr13基因的功能,通过RT-PCR方法扩增到包含OsMsr13完整ORF的cDNA克隆,构建了含有OsMsr13重组基因的过量表达载体pCAM-JIT-OsMsr13,并经农杆菌介导法将重组基因导入到水稻中.转OsMsr13株系苗期的抗逆性试验表明OsMsr13过量表达能显著地提高水稻的耐寒性,但在抗旱和耐高温方面,转基因植株和野生型9311没有观察到多大差别.     

水稻逆境响应基因OsMsr11的克隆与分析

为了挖掘新的耐逆基因,本文在应用Affymetrix水稻表达芯片分析超级稻亲本培矮64S在不同逆境(高温、干旱、低温)胁迫下、不同发育时期叶片和穗中全基因组表达模式的基础上,对其中一个多逆境响应基因OsMsr11(Oryza sativa L.multiple stressresponsive gene 11)进行了克隆与分析。OsMsr11是一个受低温、干旱、高温多逆境诱导的基因,在孕穗期低温胁迫下表达水平显著上调。通过PCR扩增获得了包含其完整开放阅读框的cDNA序列。序列分析表明,其ORF为234 bp,编码77个氨基酸,有信号肽序列,无典型的保守基因结构域,预测其为分泌通路信号肽,分泌到细胞周质中,功能未知;OsMsr11基因不含内含子,对其启动子区域进行分析,发现含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。为研究其功能,采用农杆菌侵染法转化超级稻父本9311,初步分析表明:在水稻中过量表达OsMsr11,增强了转基因水稻的耐盐性,降低了对外源ABA的敏感性。     

一个水稻抗逆候选基因OsHMGB3的鉴定与评价

OsHMGB3是一个位于水稻抗旱QTL区段内的抗旱相关候选基因,预测编码一个具有HMGB-UBF-HMG-box结构域的蛋白。Real-time PCR分析表明:OsHMGB3基因在多个组织器官中表达,且能够受到PEG、NaCl、低温、高温等逆境及ABA的诱导表达。对超表达OsHMGB3的转基因水稻进行了苗期甘露醇胁迫处理,转基因植株的鲜重和株高均极显著优于野生型植株,超表达OsHMGB3可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力。该基因对逆境的响应及转基因植株对渗透胁迫的抗性均暗示该基因与水稻抗逆性有密切的关系。     

OsBELL4A调控水稻WOX家族基因表达及水稻幼苗生长和耐逆

根系不仅对地上部分起着重要的支撑作用,也是植物吸收水分和养分的主要器官。为了研究BELL家族因子在植物生长发育及逆境胁迫应答中的功能,通过与拟南芥序列对比,鉴定到水稻4个BELL4同源基因,它们的启动子含有ABRE、GARE、ERE、ARE和DRE等应答逆境胁迫和激素信号的元件。在水稻根中进行实时定量PCR分析表明,这4个BELL4同源基因不仅受到干旱、低温以及盐等逆境胁迫诱导,而且还受到植物激素乙烯、赤霉素以及脱落酸的调控,表明这些基因可能应答多种激素及逆境胁迫。进一步分析OsBELL4A干扰材料表型发现,抑制OsBELL4A基因能够促进WOX家族基因的表达水平,并抑制水稻苗期初生根生长,但使冠根数量增多。这些结果表明水稻BELL4同源基因OsBELL4A在水稻根系发育及逆境胁迫应答中可能具有重要的调控功能。     

水稻基因OsVDAC3的逆境功能分析

水稻OsVDAC3是编码一个可能12次跨膜的线粒体基因,芯片数据显示该基因在水稻根和花器官中表达最强,并受干旱、盐及多种激素显著诱导。以T1代OsVDAC3超表达转基因植株为材料,实时荧光定量PCR技术检测植株中基因OsVDAC3的表达水平,筛选超表达家系进行盐胁迫和甘露醇胁迫试验,结果显示超表达OsVDAC3能显著增强水稻的抗逆性,表明OsVDAC3是水稻逆境胁迫中的正调控因子。     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

高等植物非生物胁迫应答基因及其产物研究进展

干旱、高盐和低温等逆境是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因素。植物在逆境胁迫下,能感知并传导胁迫信号,从而引发一系列的分子反应,使某些基因得以表达以适应逆境。对这些基因编码产物的研究进展进行了综述,讨论了这些胁迫应答基因及其产物的研究现状、发展动态和应用前景。     

水稻GSK基因家族的鉴定及其对多种激素和逆境应答的表达量分析

通过序列比对分析鉴定出9个GSK同源基因(命名为OsGSK1-9),它们分布在水稻的6条染色体上。聚类分析表明预测的OsGSK蛋白和其他植物中的GSK蛋白可被分为4个亚组。通过实时定量PCR进一步分析了OsGSK基因家族的基因在水稻各种组织和器官以及在多种逆境胁迫和植物激素处理条件下的表达量。结果表明:大多数OsGSK基因在水稻全生育期都有较高的表达量并且受多种激素(如脱落酸、生长素、油菜素内酯)和逆境(如干旱和盐胁迫)胁迫诱导表达,表明OsGSK基因家族在水稻发育和逆境适应过程中可能起重要作用。     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.