牡丹ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

利用CTAB改良法提取牡丹洛阳红花瓣总RNA,通过反转录酶和设计的ACC氧化酶基因特异引物合成709bp目的片段,进行测序和比对,以确定目的片段的正确性。在709bpACC氧化酶基因片段和pBI121植物表达载体上选择合适的酶切位点,进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切。将709bp片段上切下的510bp片段反向插入pBI121植物表达载体35S启动子后面,构建成含510bp牡丹ACC氧化酶基因反义表达载体。最后采用电击法转化进感受态农杆菌GV3101,以备用于花粉管通道法转化牡丹。     

甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因正反义表达载体的构建

为了改善甜瓜果实的品质及研究甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的生物学功能,本试验分别构建了甜瓜果实SPS基因的正义及反义表达载体。用PCR方法将克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用带有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增,然后将该扩增片段克隆到pMD19-T Simple载体上,再用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切,得到该基因编码区3.37 kb的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/XbaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的正义表达载体。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用KpnⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区830 bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。     

天麻抗真菌蛋白cDNA克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术扩增出天麻抗真菌蛋白(Gastrodia antifungal protein,GAFP)的cDNA序列,通过pGM-T载体转入大肠杆菌JM109克隆,在培养基上筛选重组质粒酶切鉴定,阳性克隆经限制性内切酶Xba1和Sac1酶切与同样酶切的植物表达载体pBI121连接,构建天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体pBI121-GAFP。结果,天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体构建成功。     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

［目的］研制小反刍兽疫羊痘活载体疫苗。［方法］利用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒H基因,克隆到pGEM-T easy载体,Nhe Ⅰ和Hin-d Ⅲ双酶切重组质粒,将目的片段插入到真核表达载体pEGFP-N1-P7.5中,得到重组载体pEGFP-N1-P7.5-H,重组载体Hin-d Ⅲ、NheⅠ双酶切片段EGFP-P7.5 H平末端连接到KpnⅠ 酶切后的载体pUC119-TK中,得到通用转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-H。［结果］经酶切鉴定及PCR扩增检测,表明构建载体正确。pUC119-TK-EGFP-P7.5-H转染羊痘病毒感染的BHK21细胞,48 h后报告基因表达。［结论］该研究为研制小反刍兽疫基因工程活载体疫苗奠定基础。     

新城疫病毒La Sota株F基因重组pGAPZα的构建

根据新城疫病毒(NDV)La Sota株F基因序列和毕赤酵母表达载体pGAPZαA多克隆位点序列,设计并合成3对引物,以RT-PCR技术获得NDV La Sota株融合蛋白(F)基因的F1片段和F2片段。将目的基因和质粒pGAPZαA均以KpnⅠ和XbaⅠ进行酶切,以DNA连接酶进行连接并转化Escherichia coliDH5α,转化子经PCR鉴定和酶切鉴定,结果表明构建的重组质粒中含有目的基因片段。将目的基因片段的测序结果与NDV La Sota株F基因序列比对,长度和核苷酸序列一致。     

A型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建

采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代.     

仙客来热激蛋白基因HSP21.4植物表达载体构建及鉴定

试验以仙客来热激蛋白基因HSP21.4为材料,经PCR扩增的方法在目的片断两端添加SacⅠ位点,然后与植物表达载体pBI121连接,转化感受态大肠杆菌,经PCR和SacⅠ及XbaⅠ酶切验证,确定已将该热激蛋白基因连接到植物表达载体上,将重组质粒命名为pBI-CpHSP21.4,并采用冻融法完成了对pBI-CpHSP21.4质粒的农杆菌转化,为验证该热激蛋白基因的功能及转基因植物表达奠定基础。     

紫杉醇合成途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

从南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）愈伤组织提取总RNA，根据已发表的中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA序列设计两对引物，通过RT-PCR技术扩增出该酶5’端长度为1201bp和3’端长度为1388bp的两个cDNA片段，将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E. coli DH5α中， 5’端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定，3’端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后，对阳性克隆进行序列测定，证实确为紫杉烯合成酶基因。将这两个cDNA片段拼接到一起，得到全长2589 bp的紫杉烯合成酶基因，编码862个aa，与中国红豆杉紫杉烯合成酶基因具有98%的同源性。两片段与双元载体pCAMBIA1300以T4 DNA连接酶连接并转化到E. coli DH5α中，经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定，证实紫杉烯合成酶cDNA全长连接成功并插入到pCAMBIA1300中，为下一步的转基因工作做好了准备。     

蝴蝶兰ACC氧化酶和ACC合成酶融合反义表达载体的构建

为了获得具有超常花期的蝴蝶兰新品系,根据已报道的蝴蝶兰ACC合成酶(ACS)基因和ACC氧化酶(ACO)基因的序列,设计引物从蝴蝶兰总RNA中克隆出ACS保守区的461 bp片段和ACO的333 bp片段,完成2个基因的克隆和测序后,将ACS基因片段和ACO基因片段以反义的方向插入到中间载体pBI221 CaMV启动子...     

黄河蜜甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶基因片段的克隆和反义载体的构建

从伤诱导的黄河蜜甜瓜(Cucumismelocv.Huanghemi)成熟果实的中果皮组织中分离总RNA,经反转录和PCR扩增得到974bp的cDNA片段,克隆到质粒载体pGEM-3zf,经测序与Genbank中甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶(1-amino-cyclopropane-1-carboxylieacidsynthase,ACS)基因同源性为99%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建成ACS基因的反义表达载体。     

薄皮甜瓜果实ACC合成酶cDNA克隆及反义表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(Cucumis melo cv.Qitian I)果肉组织中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到0.7 kb的cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。测序表明,该基因为777 bp,编码258个氨基酸,与Gen-Bank中甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因比对,核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为98%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pCAM2301的E8启动子和NOS终止子之间,构建成E8调控下ACS基因反义表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

牡丹ACS基因克隆及序列分析

ACC合成酶(ACS)是乙烯生物合成的关键酶。为了明确牡丹ACC合成酶基因的结构,基于报道的牡丹ACScDNA(DQ337250)序列,设计一对特异性PCR扩增引物,以洛阳红牡丹(Paeonia suffuticosa Andr.)新鲜叶片总DNA为模板,用高保真DNA聚合酶KOD-Plus成功地扩增出长度约为2 200bp的PCR产物;用pMD18-T载体对PCR产物进行了克隆,测序结果表明,牡丹ACS基因序列全长2 251bp,含4个外显子和3个内含子,剪接位点均为保守的5′供位GU与3′受位AG模式,4个外显子分别居于1-174、267-398、483-643、1 240-2 251bp;序列已提交至GenBank数据库,其登录号为FJ769773;牡丹ACS蛋白由492个氨基酸组成,与苹果、枇杷、西洋梨、天竺葵等ACS的相似性达74%～76%;生物信息学分析预测牡丹ACS蛋白的分子量为54.9kD,等电点为6.8,是一个定位于细胞质的不稳定的非分泌亲水蛋白。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析(英文)

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行其序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并通过DNAman、NCBI Blast、ExPASy ProtParam等工具,对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。由SS基因翻译出来的蛋白质分子量为47.8394KDa,理论等电点为8.57,无信号肽。疏水性分析表明,在400~417区域疏水性较强。跨膜区分析表明有3处跨膜区域,分别为170～186位的17个氨基酸、282～305位的24个氨基酸、387～407位的21个氨基酸。通过NCBI的BLAST程序分析指出,该基因编码的氨基酸序列含有Trans_IPPS_HH的保守区域,也具有与Mg2+结合有关的活性中心——富含天门冬氨酸的区域(DXXDD)。2级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

1-MCP对苹果果实贮藏期间乙烯合成代谢的影响

 以红富士(MalusdomesticaBorkhvar.RedFuji)苹果果实为试材,研究了1-MCP(1-methylcyclopropene,1-甲基环丙烯)对果实贮藏期间乙烯生物合成代谢过程的影响。结果表明,1-MCP维持果实硬度、降低果实的呼吸速率、脂氧合酶活性和乙烯的释放。进一步研究表明,1-MCP处理抑制果实贮藏15d后体内ACS活性,增加ACC含量的积累,延迟ACO活性高峰的出现,并抑制果实乙烯跃变期间蛋白激酶活性的升高。     

Effects of 1-MCP on Ethylene Synthesis and Metabolism of Apple During Storage

Red Fuji apple (Malus domestica Borkh var. Red Fuji) fruits were used to study the effect of 1-MCP on ethylene biosynthesis metabolism during storage. The results showed that 1-MCP maintained the firmness and inhibited the respiration rate, LOX activity and ethylene production rate of fruits. Further study indicated that 1-MCP inhibited ACS (ACC synthase) activity from the 15th day, increased ACC accumulation,and delayed the appearance of ACO (ACC oxidase) activity peak. The increase of protein kinase activity was also inhibited by 1-MCP during fruit ethylene climacteric time.     

高等植物ACS基因家族及其功能研究进展

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶(ACS)是乙烯合成过程中的限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用:在低氧、高温、激素胁迫等环境及果实成熟过程中ACS基因都会调控ACS表达量的明显变化从而影响乙烯的合成,进而影响植株的生长。对国内外该基因在不同环境下的表达量变化进行综合论述,以期为今后ACS基因的研究提供重要信息和有价值的参考。