MeNINVs在不同品种木薯的表达模式及酶活性分析

碱性/中性转化酶(NINV)催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖,是木薯块根的蔗糖分解代谢的关键酶之一。本研究以淀粉含量不同的木薯品种(SC8-高淀粉,SC124-中淀粉,9Ⅰ-低淀粉)为材料,研究木薯块根膨大期,Me NINV基因家族在源库器官的表达模式以及酶活性特点。结果表明,不同品种木薯Me NINVs的表达模式相似,Me NINV1、Me NINV16、Me NINV110及n INV1在叶片中表达量均高于其他成员;同时,Me NINV1和NINV1在块根中的表达量也高于其他成员。不同品种木薯叶片中的Me NINVs表达及酶活性差别不大,但是高淀粉品种SC8块根中的Me NINVs表达量比9Ⅰ低,而NINV酶活性却远高于9Ⅰ,推测木薯NINV酶活性存在转录后调控机制。本研究为进一步研究碱性/中性转化酶在木薯淀粉积累过程中的作用奠定了基础。     

木薯AGPase大亚基MeAGPL3基因启动子调控区域鉴定

木薯是重要的热带作物,具有高淀粉积累等特点,但其高效积累机制尚不明确.为研究腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大亚基对木薯淀粉积累的调控作用,本研究通过RT-PCR技术对木薯AGPase 5个大亚基基因(MeAGPL1～MeAGPL5)进行筛选,发现MeAGPL3基因在木薯块根中高表达且受100 μmol/L外源ABA正向调控;克隆了该基因2455 bp 5'侧翼序列,利用该序列及4个不同长度的5'端截短片段分别与β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因融合构建表达载体,转化本氏烟草,通过检测各转基因烟草GUS蛋白活性,发现-1至-1711 bp序列具有最佳的启动活性.利用100 μmol/L外源ABA处理各转基因烟草株系,分析处理前后GUS蛋白活性变化,发现ABA信号响应元件分布于-1711至-2150区域.本研究为从转录调控角度阐释木薯淀粉高效积累机制提供理论支撑.     

辣椒14-3-3蛋白基因家族全基因组鉴定与表达特征分析

14-3-3蛋白(GRF)基因家族通过与靶蛋白相互作用,广泛参与植物激素信号转导和生理代谢过程,在植株生长发育和逆境响应中发挥重要作用。本研究以辣椒(Capsicum annuum)为材料,利用生物信息学研究方法,鉴定得到15个辣椒14-3-3基因家族成员,命名为CaGRF1～CaGRF15。系统分析了CaGRF基因家族成员的结构、进化关系、启动子顺式作用元件、组织及冷胁迫表达,并对CaGRF蛋白互作网络进行预测。结果表明,根据进化关系CaGRF家族成员被分为ε类和非ε类,ε类CaGRF含有更多外显子和内含子;启动子序列分析发现CaGRF启动子中有多个响应激素、胁迫、光的顺式作用元件;表达分析表明CaGRF各成员在辣椒各组织和冷胁迫响应中特异性表达;蛋白互作网络预测发现CaGRF可能与氮代谢、质子转运、转录调控相关蛋白互作。本研究为深入研究辣椒14-3-3家族成员功能及调控途径提供了参考。     

木薯MeSWEET3b的基因克隆及功能分析

SWEET基因家族是近年新发现的一类糖转运蛋白家族,对植物的生长发育、激素平衡及植物与微生物互作等方面有着重要的调控作用。为了探索木薯SWEET基因的功能,本研究通过RT-PCR的方法从木薯主栽品种‘华南9号’(SC9)的叶片中克隆得到了木薯MeSWEET3b基因,并对其进行了生物信息学分析和功能的初步探究。结果表明,木薯MeSWEET3b蛋白具有典型的SWEET蛋白结构域的特征,含有2个Mt N3＿slv结构域和7个跨膜螺旋;MeSWEET3b与拟南芥AtSWEET3基因、水稻OsSWEET3a、OsSWEET3b基因高度同源,都属于CladeⅠ的第一分支;木薯MeSWEET蛋白定位在细胞膜上,且行使转运半乳糖的功能。此外,木薯MeSWEET3b基因还受到木薯黄单胞菌Xam的诱导而高表达。本研究明确了木薯SWEET家族成员MeSWEET3b转运半乳糖这一重要功能,且受到病原菌Xam的诱导表达。本实验结果为进一步揭示木薯体内光合产物从源到库的运输分配以及木薯与微生物互作机理提供了理论依据。     

大豆14-3-3蛋白与转录因子蛋白GmMYB173的互作

14-3-3蛋白家族在真核生物中普遍存在,可与其他蛋白相互作用,调控多种生理生化过程。MYB基因家族作为植物中最大的一类转录因子,广泛参与了植物的生长发育和代谢调控。本研究通过分析1个从自贡冬豆中克隆的MYB转录因子GmMYB173的亚细胞定位情况,发现GmMYB173在细胞核中特异表达;序列分析发现GmMYB173与GmMYB176相似,具有1个14-3-3蛋白的潜在结合结构域,即pST结合结构域。通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)删除了GmMYB173序列中pST结合结构域编码序列,发现GmMYB173细胞核表达特异性消失。酵母双杂交互作分析表明,大豆基因组中所有具有表达的16个14-3-3蛋白GmSGF14a~GmSGF14p均能与GmMYB173互作。β-半乳糖苷酶活性分析发现,与GmMYB173互作最强的是GmSGF14n,GmSGF14k、GmSGF14e和GmSGF14o其次。这些结果说明14-3-3蛋白不仅与GmMYB173互作,且可能调控其在细胞内的定位,有助于研究14-3-3蛋白与GmMYB173的互作关系及其在大豆生长发育中的作用。     

甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员鉴定及表达分析

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物,细胞壁蔗糖转化酶是植物源、库组织蔗糖代谢的关键酶,但关于甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员的研究尚未见报道。本研究测定供试品种不同组织部位的蔗糖淀粉含量,利用生物信息学方法对IbCWIN基因家族的理化性质、保守结构域、系统进化关系、启动子作用元件、组织特异性表达模式进行分析。结果表明,甘薯茎中蔗糖含量最高,须根和叶次之,块根最低;块根淀粉含量最高,极显著高于其他部位。甘薯中含有10个IbCWIN基因,编码氨基酸442～1115个,蛋白质分子量范围49.56～124.44kD,等电点为5.0～9.1。分布在8条染色体上,都含有Glyco₃2保守结构域及相同或相似的保守基序motif,属于糖基水解酶基因家族GH32。IbCWIN与木薯MeCWINV同源性高, IbCWIN基因家族启动子区域含有多种类型的顺式作用元件。qRT-PCR结果表明,IbCWIN基因家族在甘薯不同组织中均有表达且有多种表达模式,其中IbCWIN2和IbCWIN9在块根中表达量显著高于其他组织部位。本研究为下一步探索甘薯IbCWI...     

水稻3-磷脂酰肌醇激酶FAB1/PIKfyve基因家族的鉴定及功能分析

FAB1/PIKfyve是催化3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)形成3,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3,5)P2)过程的关键酶,其产物PtdIns(3,5)P2在真核细胞发育中发挥重要功能.为探寻PtdIns(3,5)P2在水稻生殖发育过程中的功能,本研究结合生物信息学和遗传学方法,对水稻FAB1/PIKfyve基因进行鉴定,分析其理化性质、基因结构、保守结构域、系统进化、顺式作用元件和组织表达模式并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体.生物信息学分析结果显示,水稻基因组中共鉴定到9个FAB1基因家族成员;基因结构分析显示FAB1家族基因结构存在差异,外显子数量为8～12个;保守结构域分析表明仅OsFAB1A和OsFAB1B含有N端FYVE结构域,其余成员具有Cpn60_TCP1结构域和PIPKc激酶结构域;系统进化分析提示FAB1家族功能在单双子叶植物中具有高度保守性;FAB1基因上游调控区域顺式元件预测发现多种生长发育相关、光响应以及激素和胁迫响应顺式元件;组织表达模式分析显示大多数FAB1基因为泛表达,其中FAB1C亚类基因在内外稃中的高表达提示其可能参与花器官发育.最后通过CRISPR/Cas9系统得到osfab1b突变体,经碘染观察花粉活力无明显异常,暗示FAB1家族在水稻生殖发育调控中存在功能冗余.本研究结果为单子叶模式植物水稻中磷脂酰肌醇调控网络及其生物学功能的研究提供了理论参考.     

毛果杨YABBY基因家族生物信息学分析

YABBY基因家族是仅存在于植物中的一类含有C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域的转录调控因子,与植物的形态发育有关,在植物的茎、叶和花等器官的生长发育过程中起到重要的调控作用。本研究通过对毛果杨(Populus trichocarpa) YABBY基因家族生物信息学分析,共筛选出12个YABBY家族成员,分别位于第1、2、3、6、8、9、10、14、16和18号染色体。这些成员结构域保守,且具有低亲水性的特点。通过亚细胞定位预测,所有成员都定位在细胞核中。基因组织表达分析表明,毛果杨YABBY家族成员在不同组织中的表达有明显不同,在雌花、雄花和芽中表达量较高。     

木薯MeRSZ21a的克隆、生物信息学分析和表达模式分析

在非生物胁迫过程中,植物中SR蛋白(serine/arginine-rich proteins, SR)发挥着重要作用。本研究利用生物信息学分析方法,对木薯MeRSZ21a基因结构、理化性质、结构域、保守基序、系统进化等方面进行了分析,并分析MeRSZ21a在各组织中的表达,以及胁迫后其剪接模式和表达水平。我们之前的研究表明,木薯MeRSZ21a是SR蛋白家族中RSZ亚家族的成员之一。本研究结果表明MeRSZ21a基因全长为2 263 bp,编码160个氨基酸,蛋白大小为18 kD,属于亲水性碱基蛋白。MeRSZ21a含有RRM和zf-CCHC结构域,与野生大豆亲缘关系最近。在3个木薯品种‘W14’、‘Arg7’和‘Ku50’各组织中,MeRSZ21a在发育前期组织中表达量较低,在成熟的侧芽与叶组织器官中表达量较高。胁迫处理后,MeRSZ21a的转录本及表达量发生较大变化,其中叶片中转录本数均上升,并且对木薯进行不同温度(42℃,-3℃)胁迫处理后,根和叶中MeRSZ21a的表达水平显著性上调,表明在响应胁迫过程中,MeRSZ21a发挥着重要作用。这有助于进一步探索木薯MeRSZ21a在植物响应非生物胁迫中的功能。     

星油藤WOX基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

本研究利用星油藤(Plukenetia volubilis L.)转录组及基因组数据库,通过本地BLAST,筛选到了9个星油藤WOX (PvoWOX)基因家族成员,并对它们编码的蛋白质氨基酸序列、分子量和等电点等进行了预测。通过构建系统进化树,将该基因家族成员分为3个进化支,分别为远古支、中间支和WUS支;进一步对PvoWOX家族成员的基因结构和蛋白保守结构域分析发现在同一进化支中均很保守,并且家族成员均含有保守的同源异型结构域,其中WUS支的成员都含有WUS-box结构域。利用转录组数据和qRT-PCR对PvoWOX基因家族成员在星油藤不同器官中的表达谱进行了分析,结果显示9个PvoWOX基因成员具有不同的表达模式,其中WUS支和中间支成员的表达具有组织特异性,而远古支成员则在不同的器官中均有表达。因此推测Pvo WOX家族成员具有功能多样性,分别参与调控星油藤不同器官的发育过程。本研究结果为进一步研究PvoWOX的生物学功能提供了帮助。     

木薯内源激素含量与块根淀粉积累关系研究

为探讨木薯内源激素(IAA、ABA、GA3、CYT)含量和块根淀粉积累的关系,分别对高低淀粉木薯品种不同时期块根、茎秆、叶片内源激素(IAA、ABA、GA3、CYT)和块根淀粉含量变化进行研究。结果表明：块根、茎秆、叶片中IAA含量变化趋势一致,在块根形成期达到最大值;块根、茎秆内ABA、GA3,叶片内ABA与块根淀粉含量呈极显著正相关关系,其中茎秆ABA、GA3主要是通过影响光合产物的装载和运输来促进块根淀粉的积累;在块根形成期和膨大期,高淀粉木薯品种‘辐选01’块根内CYT含量高且持续时间长。叶片中IAA、CYT、GA3与块根淀粉含量呈极显著负相关关系,随着块根成熟,这3种内源激素都有不同程度的上升趋势,可能与它抗衰老的能力有关。在块根膨大期,‘华南124’茎秆GA3含量极显著高于‘辐选01’,‘辐选01’块根、叶片ABA含量在生长后期显著高于‘华南124’,说明低淀粉木薯品种后期不易早衰,但地上部分生长过旺不利于块根淀粉积累。     

八个木薯品种(系)储藏根采后耐贮性生化指标的变化

选用8个木薯品种(系)调查和评价储藏根采后3、7、12、17和27 d贮藏保鲜过程,发现其耐贮存性从高至低依次为SMH、BRA755、SC205、SC5、BRA440、7G-2、T1和BRA258。利用线性回归分析表明,木薯储藏根贮存变质抗性与干物质含量呈负相关,相关系数r为0.687 (P=0.05);与淀粉率含量呈负相关,相关系数r为0.696 (P=0.05);与储藏根氢氰酸(HCN)含量无相关性。其中SMH贮存变质抗性最强,储藏根干物质和淀粉含量最低;BRA258和T1贮存变质抗性最差,干物质和淀粉含量最高,因此这3个木薯品种(系)在育种上具有较高的利用价值。     

小麦胚乳14-3-3蛋白的表达及其淀粉体淀粉合成酶的互作

从小麦胚乳中克隆了14-3-3基因,并将其分别插入pET29c和pET41c质粒,用热激法转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到高效表达的蛋白,但融合蛋白主要以包涵体的形式存在。可溶性的融合蛋白可直接通过S-蛋白琼脂糖树脂纯化。包涵体经8 mol L^-1尿素溶解变性,稀释复性后,结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,也得到纯化的融合蛋白。复性后的融合蛋白对蔗糖合成酶活性表现抑制作用,说明包涵体14-3-3融合蛋白恢复活性。将结合14-3-3融合蛋白的S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交,与14-3-3蛋白特异互作的淀粉合成酶结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,Western 检测结果表明, 淀粉体淀粉合酶I(SSI)、淀粉合酶II(SSII)、淀粉分支酶IIa(SBEIIa)、淀粉分支酶IIb(SBEIIb)和ADP焦磷酸化酶大亚基(SH2)与14-3-3蛋白存在互作,而淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与14-3-3蛋白结合,说明小麦胚乳14-3-3蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用。     

枸杞Lb14-3-3基因家族cDNA克隆及生物信息学分析

在开花植物中,14-3-3蛋白对植物生长发育具有重要的调控作用。本研究在前期枸杞花药发育差异蛋白质组研究基础上,利用RT-PCR技术,从宁夏枸杞‘宁杞1号’花药中克隆了5条长度分别为768 bp、747 bp、777 bp、753 bp和777 bp的cDNA序列,分别命名为Lb14-3-3a、Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e,对Lb14-3-3a、Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e,5个基因编码蛋白质的结构预测发现,其蛋白质的分子量大小在60.91~64.14 kD之间,编码蛋白质的长度在248~259个aa之间,理论等电点在4.95~4.99之间,均为酸性氨基酸,且都为不稳定的亲水性蛋白。α-螺旋(Alpha helix)是这5个蛋白质二级结构的主要成分,三级结构主要是由α-螺旋构成的对称结构,具有高度的相似性。该家族蛋白既没有信号肽也无明显的跨膜区,亚细胞定位显示Lb14-3-3a定位在线粒体上,Lb14-3-3b和Lb14-3-3e定位在叶绿体上,Lb14-3-3c和Lb14-3-3d定位在细胞质中,Lb14-3-3a蛋白发生磷酸化修饰的可能性最高,Lb14-3-3b磷酸化的可能性最低。多序列比对分析显示,该家族蛋白之间的相似性为77.51%,具有高度的保守性。进化分析显示Lb14-3-3a与其它Lb14-3-3蛋白家族的亲缘关系较远,Lb14-3-3c和Lb14-3-3e,Lb14-3-3d和Lb14-3-3b处于同一分支,亲缘关系较近,Lb14-3-3家族蛋白与马铃薯、番茄、烟草等亲缘关系较近。研究结果为阐明该蛋白家族基因在枸杞花药发育过程中潜在的调控机理提供科学依据。     

葫芦科14-3-3(GRF)基因家族的鉴定及进化分析

14-3-3蛋白是植物中一类高度保守的蛋白家族,因其特异识别并结合靶蛋白的磷酸化位点而广泛参与植物生长发育和逆境胁迫响应过程。为系统地了解14-3-3(GRF)基因家族在葫芦科作物中的基本特征和进化关系,本研究利用生物信息学从葫芦科7个物种基因组内共鉴定出83个14-3-3(GRF)基因,其中西瓜中有10个、甜瓜中9个、黄瓜中10个、瓠瓜中9个,3个南瓜属物种基因组各15个。理化特性表明14-3-3(GRF)蛋白的分子量约为30 k D,且大都为酸性氨基酸(pI<7.0)。相对于西瓜、甜瓜、黄瓜和瓠瓜,基因组复制事件是3个南瓜属物种内14-3-3(GRF)基因数目增多的主要原因。进化分析显示,葫芦科14-3-3(GRF)基因家族可进一步被划分为ε类和非ε类亚组,且后者的基因结构(外显子数目,内含子相位)较为保守。本研究结果首次完成了14-3-3(GRF)基因家族在葫芦科作物的鉴定、基因结构、基因家族扩增、共线性及进化分析,为更深入研究该家族基因的生物学功能提供参考。     

高低淀粉木薯品种可溶性糖运转、分配与块根淀粉积累的关系研究

在大田条件下,试验以华南124,辐选01为材料,分别在各生育期测定块根淀粉积累量和根茎叶可溶性糖积累量,研究木薯可溶性糖运转、分配与块根淀粉积累的关系。结果表明,从块根形成初期到成熟期,块根可溶性糖呈明显下降的趋势,而茎和叶的可溶性糖先是随块根淀粉积累速率的升高而下降,后又在淀粉积累速率下降时明显升高,和淀粉积累速率趋势相反。在块根形成初期,可溶性糖的分配是块根积累量大于茎杆,茎杆大于叶片,而在成熟期,块根可溶性糖的积累量小于茎杆,茎杆小于叶片。由此可见,木薯可溶性糖的运转、分配与块根淀粉积累关系密切,限制块根淀粉积累的主因是库限制。另外,高淀粉品种有更强的合成和转化利用可溶性糖的能力。     

烟草Nt14-3-3-like C基因的克隆与功能分析

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）寄主范围广泛、传染性极强,严重影响作物的产量和品质。实验室前期在不同耐受 TMV侵染的烟草品种中筛选出1个表达显著差异的蛋白14-3-3-like C,在此基础上,对Nt14-3-3-like C基因进行了克隆、生物信息学分析和亚细胞定位;通过农杆菌介导遗传转化,获取转基因植株;通过qPCR对转基因植株中TMV侵染响应相关基因的表达进行分析。结果显示,14-3-3-like C蛋白序列长度为780bp,编码260个氨基酸,具有14-3-3蛋白的典型沟槽结构,但没有跨膜结构和信号肽;定位于细胞核和细胞膜;转基因材料的qPCR分析发现,在Nt14-3-3-like C基因抑制的植株中,病原防卫和光合途径相关的基因表达显著下降,表明Nt14-3-3-like C可能通过抑制病原防卫和光合途径相关基因表达参与TMV对烟草的侵染。     

棉花Gh14-3-3L2基因的分子克隆及其互作蛋白质的初步鉴定

根据本实验室蛋白质组学研究鉴定的EST序列,克隆了一个可能在棉花纤维起始和伸长发育阶段起调控作用的棉花14-3-3蛋白质的全长cDNA,定名为Gh14-3-3L2。Gh14-3-3L2蛋白毒性大,难以通过酵母双杂交途径鉴定其互作蛋白质组。因此,本研究首先经原核表达并纯化出添加六联组氨酸标签的Gh14-3-3L2蛋白,以此蛋白质为诱饵,以开花前3 d至开花后6 d正常野生型、徐州142无纤维突变体和Li-1无长绒纤维突变体胚珠或纤维混合蛋白质为猎物样品,采用Pull-down技术分离、富集Gh14-3-3L2相互作用蛋白质,再经2-DE和MALDI-MS/MS串联质谱分析,鉴定了7个可能与Gh14-3-3L2相互作用的蛋白,其功能有作为分子伴侣、参与微囊的运输、代谢、信号转导等。为进一步解析Gh14-3-3L2的功能以及棉花纤维发育的分子调控网络奠定了基础。     

The effect of genotype,location and season on cassava starch extraction

When cassava is harvested too early, it often leads to reduction in yield, while delayed harvest leads to development of woody and fibrous tuberous roots, and reduction in starch content. The optimum harvest time is not known. The objectives of this study were to determine the effect of genotype, location and season on starch extraction in order to find an optimum harvest regime for cassava, and to find the best parameter for monitoring starch levels in cassava tuberous roots. Results showed that genotypic effect was large for starch weight, starch extraction rate on fresh weight basis, and root dry matter content. This suggested that high starch weights could be realised by selection of suitable varieties for starch extraction. It was found that cassava harvesting and starch extractions should be done between October and November since the highest starch extraction rates were achieved during that period, and drying of the extracted starch using the open air method was fast and convenient. The results also suggested that starch levels can efficiently be monitored using starch extraction rate on fresh root weight basis. Starch content on fresh root basis and root dry matter content can also be used to determine the optimum time to harvest cassava for starch extraction but were inferior to starch extraction on fresh root weight basis.