大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

[摘要〕目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法〔方法采用改良全骨髓贴壁 方法,分离和纯化3-4周的大鼠BMSCs,镜卜连续观察细胞的形态变化、流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29 均表达情况〔结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁〔8-10 d可达800Ic-90%融合,纯化 青传代周期为6-8 d〔流式细胞术鉴定表明C D45阴性,CD29阳性〔结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠 }''J骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法、     

骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的动物实验研究

    探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对大鼠脑缺血的修复和治疗.体外分离培养大鼠MSCs,以Hoeschst33342标记,移植到大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的大鼠体内,分别设立缺血1 d和缺血7 dMSCs移植组与缺血对照组,对各组大鼠进行神经功能损害严重程度评分(NSS)及大脑组织切片观察比较.结果发现,缺血1 d MSCs移植组大鼠NSS评分低于另外两组,差异显著(P＜0.05),大脑组织结构清晰、完整,胶质瘢痕少;缺血7 d MSCs移植组与对照组无明显差异(P＞0.05).故缺血早期进行MSCs移植,大鼠神经功能恢复情况明显.MSCs在损伤后的脑组织内能够存活并且分化为神经元、胶质细胞等,对动物神经损伤后组织重建及功能恢复有一定的治疗作用.     

骨髓间充质干细胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中应用

探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的应用价值。通过一次性腹腔注射环磷酰胺和白消安建立小鼠卵巢早衰(POF)模型,并随机分为建模组、BMSCs移植组和空白对照组。移植组于建模14 d经尾静脉注射绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠BMSCs悬液(5×10~7个·mL~(-1)),每4 d重复1次,共5次;建模组和空白对照组注射等量生理盐水。观察建模后及BMSCs移植后小鼠的一般情况、血清FSH和E2水平、卵巢组织学变化以及GFP荧光信号在卵巢内的分布。结果发现,建模组小鼠食欲明显减退,活动减少,与空白对照组相比体重显著减轻(P0.05),FSH水平显著增高(P0.05),E2水平显著降低(P0.05),卵巢体积减小,间质纤维化严重,始基卵泡、生长卵泡和成熟卵泡数均显著减少(P0.05)。BMSCs移植后,移植组小鼠体重增加,食欲增强,活动增多;28 d后FSH浓度显著低于建模组(P0.05),E2浓度、始基卵泡、生长卵泡数及成熟卵泡数均显著高于建模组(P0.05),但各项指标仍与空白对照组间存在显著性差异;荧光显微镜下可见绿色荧光信号散在分布于卵泡周围。此结果提示,BMSCs可在小鼠损伤卵巢组织中定位存活,对卵巢组织结构及内分泌功能有修复作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的表达。结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs。     

移植骨髓间充质干细胞对雌性大鼠生长及生殖器官发育水平的影响

[目的]探讨不同生长发育阶段移植BMSCs对雌性大鼠生长及生殖器官发育水平的影响.[方法]选择80只SD雌性大鼠随机分为试验组和对照组,每组40只,体重组间差异不显著(P＞0.05):试验组用50 μL生理盐水稀释BMSCs(1×106个),进行尾静脉移植,对照组同样方法同样部位注射生理盐水.试验鼠分别第V20 d、V60 d和P18 d时试验组移植BMSCs,对照组注射等量生理盐水;试验鼠分别第V30 d、P18 d和L15 d时每组随机取8只大鼠,屠宰前(空腹12 h后)称活重,屠宰后取子宫,卵巢称重;同时宰前心脏采血制备血清,检测血清中E2、P4、GH和IGF-l水平.[结果]雌性大鼠不同生理发育阶段移植BMSCs后,P18 d时试验组大鼠血清中IGF-1、E2和P4水平显著高于对照组(P＜0.05),同时大鼠体重和子宫重显著高于对照组(P＜0.05),V30 d和L15 d时组间差异均不显著(P＞0.05);在整个试验期血清中GH水平和卵巢重组间差异均不显著(P＞0.05).[结论]移植BMSCs后能显著增加妊娠母鼠子宫,胎盘,胎儿的重量;而对其它组织的重量影响不显著.移植BMSCs后能显著增加妊娠母鼠的血清中P4、E2和IGF-l水平,而GH的变化不显著.在生长阶段和分娩后,母鼠移植BMSCs对血清中的P4、E2、GH和IGF-1水平均不显著.     

阻断大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化与肿瘤发生相关性研究

【目的】分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.阻断正常干细胞的分化过程,探讨肿瘤发生机理.【方法】利用贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛联合诱导大鼠BMSCs,使其分化为脂肪细胞.在细胞分化过程中利用3-甲基胆蒽(3-MC)阻断大鼠BMSCs的分化过程.【结果】大鼠BMSCs分化试验显示:诱导30d后经油红O染色,细胞内可见脂肪细胞特有的红色脂滴沉淀,并且随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加,脂滴增大,表明大鼠BMSCs已成功分化为脂肪细胞.大鼠BMSCs分化阻断试验显示:诱导30d后经油红O染色细胞内红色脂滴沉淀明显下降,表明阻断后的细胞具有脂肪细胞的特性,但分化不完全;形态学鉴定表现出:细胞接触抑制消失,细胞核异常,微核畸变率高,核型异常,表明阻断后的干细胞发生恶性转变.【结论】通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛的联合作用,诱导BMSCs成功向脂肪细胞分化.在BMSCs向脂肪细胞分化的过程中加入阻断剂3-MC,阻断其分化过程,表明干细胞分化过程受到阻断,细胞停止在分化的中间阶段,有转化成肿瘤细胞的趋势.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养

为探讨体外分离及培养扩增兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,无菌采取兔股骨,用含20%FBS的DMEM培养液冲骨髓腔,采用全骨髓细胞贴壁培养法对MSCs进行纯化扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况、绘制细胞生长曲线。结果显示,MSCs为贴壁生长细胞,形态均匀呈纤维样,增殖能力强,多次传代仍能保持其生物学特性。采用全骨髓贴壁培养法能够较好地纯化和扩增MSCs。     

BMP4在诱导骨髓间充质干细胞向生殖细胞分化中的作用

为了探讨骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)在诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向生殖细胞分化中的作用,将全骨髓培养法获取小鼠BMSCs,在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养液中培养传代;取生长状态良好的第三代(P3)BMSCs,分别添加不同浓度(5、10、20、40和80ng·mL~(-1))的BMP4作为实验组,未添加BMP4为对照组。4d后,MTT法和台盼蓝染色检测细胞的增殖率和存活率,实时定量PCR(RT-qPCR)检测生殖细胞阶段特异性基因(Oct4、Dazl、Fragilis、Mvh、Nobox、Stella、Stra8和Gdf9)的表达。结果发现,BMP4浓度为5~20 ng·mL~(-1)时细胞存活率和增殖率最高;BMP4浓度为20 ng·mL~(-1)组Mvh、Fragilis、Oct-4、Dazl及Stella表达水平最高,均显著高于对照组(P0.05);Nobox表达水平则在BMP4浓度40ng·mL~(-1)组最高,且各浓度组均显著高于对照组(P0.05);各浓度BMP4组Stra8和Gdf9的表达水平均与对照组间无显著性差异(P0.05)。此结果提示,BMP4浓度在20 ng·mL~(-1)时,BMSCs的存活率、增殖率及原始生殖细胞特异性基因的表达最高;BMP4在诱导间充质干细胞向生殖细胞分化过程中起重要作用。     

骨髓间充质干细胞对放射性胸腺损伤的修复作用

目的观察骨髓间充质干细胞（MSCs）对放射性胸腺损伤的修复作用.方法 C57BL/6小鼠行1.75 Gy X线全身照射,每周1次,连续4周.实验设正常对照组、照射组及照射＋MSCs组,于末次照射后30、60、90 d称量各组小鼠体质量.取胸腺组织,计算胸腺质量指数,并通过组织学观察MSCs对胸腺组织损伤的修复作用.结果辐射组和MSCs组在照射期间体质量下降,在观察期间内,小鼠体质量随时间逐渐增加,并且MSCs组小鼠体质量略高于辐射组.对照组小鼠胸腺指数随周龄增大而逐渐减小,辐射组和MSCs组小鼠随照射后时间的延长胸腺指数逐渐增加,MSCs组90 d时胸腺指数与对照组小鼠接近.通过观察病理结果可知,正常对照组小鼠胸腺组织皮、髓质结构清楚.辐射组小鼠30 d时胸腺组织淋巴细胞可见变性、坏死,细胞数量减少;60 d时辐射组可见胸腺淋巴细胞出现修复性再生与增生;90 d时辐射组可见胸腺瘤癌前病变.MSCs移植30 d时胸腺组织皮质高度增生,髓质缩小,皮髓质内可见新生的淋巴组织;60 d时胸腺结构趋于正常.结论 MSCs可促进损伤胸腺再生与修复.     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存

对分离获得的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行低温冻存研究。用红细胞裂解法体外分离培养BMSCs,采用SABC法进行鉴定;冻存后复苏,台盼蓝染色检测细胞复苏率,观察冻存时间(15d,30d,90d)对各代(P1,P3,P9代)细胞复苏效果的影响;向脂肪细胞诱导分化验证其干细胞多潜能分化特性。结果表明:BMSCs呈长梭形,聚集成旋涡状均匀生长,SABC法鉴定其为BMSCs;冻存前后P1、P3代细胞活力好,增殖速度快;P9代细胞增殖缓慢;冻存时间对P1、P3代细胞复苏率的影响不显著(P0.05),复苏率较高;但是P9代细胞复苏率极低,并且随着冻存时间的延长,细胞复苏率逐渐降低;冻存复苏的细胞向脂肪细胞诱导分化,油红浸染红色。可见:红细胞裂解液法分离获得的BMSCs生长生物学性状稳定;P3代以前冻存增殖和分化特性不受影响,可作为种子细胞用于后续研究。     

Nesfatin-1及其mRNA在大鼠生长轴中的表达

【目的】探讨Nesfatin-1在大鼠生长轴(下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、肌肉)中的定位及其mRNA的表达情况。【方法】对雌性大鼠进行深度麻醉灌注后,采集下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、腓肠肌肌肉组织,放入4%多聚甲醛溶液中固定,采用免疫组化PV-9000二步法、DAB显色技术检测Nesfatin-1在生长轴上的分布,另取雌性大鼠断头处死,取相同组织用荧光定量PCR方法检测其中Nesfatin-1mRNA的表达情况。【结果】Nesfatin-1主要分布于下丘脑的室旁核、背内侧核、室周核、外侧区、弓状核、视上核、腺垂体、胰腺的胰岛和腺泡及肝脏与肌肉中。平均光密度分析显示,Nesfatin-1在室周核和胰岛的表达量显著地高于其他组织(P0.05),在胰腺腺泡、肝脏及肌肉中的表达量则显著地低于其他组织(P0.05),在下丘脑背内侧核、外侧区和室旁核中的表达量显著高于视上核、弓状核和腺垂体(P0.05)。Nesfatin-1mRNA在胰腺中表达量最高,腺垂体次之,下丘脑和肝脏较低,在胰腺和腺垂体的表达量显著高于下丘脑和肝脏,但下丘脑与肝脏差异不显著(P0.05);在腓肠肌中未检测出Nesfatin-1mRNA的表达。【结论】Nesfatin-1及其mRNA在生长轴中的广泛表达,表明Nesfatin-1可能对大鼠生长发育具有调控作用。     

5-羟色胺4受体mRNA在仔猪不同组织的表达

5-羟色胺4受体（5-HT4R）属于G-蛋白偶联受体超家族,广泛分布于中枢神经系统和外周组织中,调节多种神经递质的生理学效应.实验采用半定量RT-PCR的方法,检测和分析了猪5-HHTR的b亚型（5-HT4bR）基因mRNA在11种组织中的表达规律.结果发现,猪5-HT4bR在除肝脏以外的10种组织中都有表达,且不同组织内的表达量存在差异,其中脑组织和肠组织表达量较高.这一结果与5-HT4R基因在人和鼠上不同组织表达规律一致.     

海门山羊GATA-4转录因子的表达

本试验选用2个山羊品种(海门山羊和安徽白山羊),采用实时定量PCR技术,检测了GATA-4转录因子在2个山羊品种下丘脑、肌肉、心脏、垂体、卵巢、肝、子宫、脾、肾和脑组织中的表达情况。结果显示:GATA-4转录因子在海门山羊各组织中都有表达,且在海门山羊下丘脑和垂体组织中GATA-4转录因子的表达量高于安徽白山羊。表明GATA-4在海门山羊下丘脑和垂体组织中的表达水平可能影响海门山羊的繁殖能力。     

鹅皮肤BMP4基因mRNA表达研究

采用荧光定量PCR方法研究BMP4基因mRNA在吉林白鹅胚胎期和生后期皮肤中表达变化规律,并采集21~29胚龄胎毛及40~130日龄鹅背部羽毛,观察羽毛生长发育规律及羽毛分支。结果表明:BMP4基因mRNA在鹅皮肤毛囊发育的整个过程中都有表达,胚胎期21~29胚龄表达量相对较低,40~70日龄时,鹅背部皮肤中BMP4mRNA表达量呈线性快速增加,在70日龄时BMP4mRNA相对表达量为2.575,是40日龄时相对表达量0.931的2.77倍,70~90日龄BMP4mRNA表达量有所下降,90~130日龄表达量呈线性快速增加,BMP4相对表达量在130日龄时达到了4.943,是40日龄时的5.31倍,是90日龄时相对表达量1.814的2.73倍。羽毛的长和直径以及羽小枝长和直径增长速度在90日龄后减慢,呈平稳增长状态。可见,BMP4基因在鹅羽毛快速发育时期低表达,在羽毛发育速度较慢的时期高表达,且在片羽分支阶段高表达,可能与羽毛分支有一定关系。     

二花脸猪Smad4基因的克隆与卵巢组织mRNA的表达水平

[目的]了解二花脸猪Smad4(common-mediator Sma4)基因的序列特征和组织表达特征,分析二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA表达水平的差异.[方法]采用克隆测序技术获得二花脸猪Smad4基因cDNA序列,利用生物信息学方法分析二花脸猪Smad4基因的序列特征和蛋白的理化性质、高级结构,RT-PCR检测其组织表达特征,并采用real-time PCR技术检测二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA的表达水平.[结果]二花脸猪Smad4基因编码区序列全长1 659 bp,编码一个含有5 52个氨基酸残基的蛋白质,氨基酸序列与其它哺乳动物的同源性均在98％以上;二花脸猪Smad4也包括3个典型的结构域(MH1、SAD和MH2).二花脸猪Smad4基因在所检测的组织中均有表达,且卵巢组织中mRNA的表达水平极显著高于商品猪(P＜0.01).[结论]二花脸猪Smad4基因可能拥有其它哺乳动物Smad4基因相同的功能及其可能与猪高繁殖力间有一定相关.     

GATA-4在不同能量水平下绵羊睾丸中的表达与定位分析

为了研究GATA-4在不同能量水平下绵羊睾丸中的表达特点及定位情况,提取睾丸组织总RNA,应用Real-Time PCR方法检测睾丸中GATA-4mRNA的表达规律,利用免疫组化技术对睾丸中GATA-4进行定位分析。结果表明,GATA-4mRNA在睾丸中的表达水平由低到高依次为:35%VFI组﹤65%VFI组﹤自由采食组;免疫组化结果显示睾丸Sertoli细胞、Leydig细胞、生精细胞均有阳性产物,阳性强度分别为:35%VFI组﹤65%VFI组﹤自由采食组。GATA-4基因在不同能量水平下具有表达差异性,对绵羊的繁殖性能具有重要的调控作用。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

绵羊UCP4基因编码序列的克隆和mRNA表达研究

【目的】克隆绵羊UCP4基因的编码序列（CDS）,分析CDS及其编码蛋白结构特点,并探讨其mRNA的发育性表达规律,以期为该基因的结构和功能研究奠定理论基础。【方法】利用RT-PCR技术从绵羊大脑组织中扩增出该基因的编码区序列,运用生物信息学方法分析UCP4蛋白的理化性质和结构特点。利用实时荧光定量PCR技术,对两个具有显著尾型差异的绵羊品种（广灵大尾羊和小尾寒羊）2、4、6、8、10和12月龄共计96个个体的8种组织（大脑、小脑、下丘脑、垂体、皮下脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪和尾部脂肪）进行mRNA表达研究。【结果】绵羊UCP4基因CDS区长972 bp,编码323个氨基酸,分子量为35.73 kDa,等电点为9.43。二级结构中α螺旋、β折叠股和环分别占56.04%、7.12%和36.84%。该蛋白为跨膜蛋白,无信号肽,但有2个糖基化位点和15个潜在的磷酸化位点。UCP4 mRNA在脑组织和脂肪组织中均有表达,但高表达于脑组织中。品种、月龄和组织对UCP4 mRNA表达均有显著影响。【结论】获得了绵羊UCP4 基因的CDS全序列,揭示了其mRNA的表达特征及其影响因素,对进一步研究该基因的结构及其与能量代谢的关系具有重要科学意义。     

藏猪心脏脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP)组织表达差异性研究

采用半定量RT-PCR法,以GAPDH基因为内参,研究藏猪背最长肌、心肌、肝脏和脂肪组织中H-FABP基因mRNA组织表达差异性。结果显示,H-FABP基因mRNA组织表达差异性显著,脂肪组织表达量高于其他组织(P<0.01);心肌表达量高于背最长肌(P<0.05);背最长肌表达量高于肝脏(P<0.01)。