巴西橡胶HMG—CoA还原酶的分离纯化

以巴西橡胶树高产无性系热研7-33-97的新鲜胶乳为材料,分离纯化HMG-CoA还原酶的实验结果表明,低温下收集胶乳,在49000g,15℃下离心60min,离心胶乳底层部分经2％BrijW-1表面活性剂处理,可将其中结合在黄色体膜上的HMG-CoA还原酶洗脱下来,经40％(NH_4)_2SO_4盐析、Blue-dextron-agarose亲和层析、Mono Q(Pharmacia)离子交换层析,可达到HMG-CoA还原酶的纯化。用C_(?) Ultrapore TM反相柱(Beckman高效液相色谱)鉴定其纯度,用DU-70酶动力学分析系统(Beckman)检测底物NADPH在340nm处的消减,测定其HMG-CoA还原酶的活性。酶促反应动力学曲线的分析结果,前20min酶的反应初速度呈线性关系;以吸收光谱曲线分析发现,HMG-CoA还原酶在280nm处有最大吸收峰;用SDS-page测定酶亚基分子量为42K道尔顿;用IEF测定该酶的等电点为pH5.8。     

橡胶树HMG-CoA还原酶基因结构序列分析

橡胶树ＨＭＧ－ＣＯＡ还原酶ｃＤＮＡ序列分析结果表明，该ｃＤＮＡ长段为１３８３ｂｐ，由此推导的氨基酸序列含有４６１个氨基酸残基。ＰＣＧＥＮＥ￣（ＴＭ）分析该ｃＤＮＡ克隆与拟南芥ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶ｃＤＮＡ序列同源性为７９．７％，氨基酸序列同源性为８０．２％，与苍鼠氨基酸序列同源性为５１％，与血吸虫氨基酸序列同源性为４８％。（１）发现ＨＭＧ－ｏｎＡ还原酶的一级结构在动物与植物之间存在较大的差异。（２）分析ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶的疏水性氨基酸图谱，发现橡胶树和拟南芥这两种植物权有１个跨膜势能区域（Ｄｏｍａｉｎ），而血吸虫、苍鼠、果蝇等几种动物却有７个跨膜势能区域，这说明该酶的二级结构在动植物之间也存在着较大的差异。（３）由于所分析的几种动植物ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶的羧基一端未见有疏水性区域，故推测具有疏水性区域Ｎ－端蛋白质与膜相结合，而酶的羧基端由于具有亲水性则起到酶的催化中心位点。（４）比较橡胶树ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶和拟南芥ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶氨基酸同源性，发现蛋白质（酶）的Ｎ－端氨基酸同源性较低，而靠近Ｃ－端同源性较高，这说明Ｃ－端部分较为保守，估计与酶的活性中心区域有关，而Ｎ－端同源性较差，估计跟酶与结合的膜不     

巴西橡胶树橡胶延长因子cDNA的克隆及序列测定

在巴西橡胶树中，乳管晨的橡胶粒子是橡胶生物合成的场所。橡胶延长因子这种１４千道尔顿的蛋白质与橡胶分子按１：１在橡胶粒子上结合。为了获得更多有关ＲＥＦ的功能及其在橡胶粒子中的合成，装配等方面的信息，我们分离了编码ＲＥＦ的ｃＤＮＡ克隆。     

巴西橡胶树叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆到一个叶绿体型FBPase基因,命名为HbcpFBPase。该基因的c DNA全长为1 512 bp,包含1 209 bp的开放阅读框,编码一个由402个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量大小约为43.88 ku,理论等电点为6.64。多重序列比对表明该基因为叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶。Target P软件预测HbcpFBPase在叶绿体中的概率是0.961。实时荧光定量PCR分析表明,HbcpFBPase基因在雌花中表达量最高,雄花及种子次之;此外,机械伤害和割胶以及多种植物激素如乙烯利ET及植物生长素2,4-D可使HbcpFBPase基因下调表达。研究结果对进一步研究橡胶树光合作用碳固定、以及深入研究光合作用与胶乳合成之间的关系提供理论参考。     

巴西橡胶树HbRD22基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术从低温诱导的巴西橡胶树全长cDNA文库中获得了HbRD22基因,该基因全长1 458 bp。生物信息学分析结果表明,HbRD22编码一个由338个氨基酸组成的、相对分子量为36.96 ku、等电点为7.65的多肽,并含有一个由217个氨基酸组成的BURP结构域。其推导的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达69%。信号肽预测结果表明HbRD22蛋白为分泌型蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽区域。Northern blotting分析结果表明,该基因在正常生长情况下,表达水平较高,干旱胁迫后24 h,表达量逐渐减低,直至检测不到,揭示该基因受干旱胁迫负调控。     

巴西橡胶树SnRK1家族基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶I(Sn RK1)是植物糖信号途径的关键因子,广泛参与植物生长发育。以蓖麻Sn RK1基因序列为探针,采用同源克隆的方法获得了橡胶树Sn RK1家族2个基因的全长c DNA,分别命名为Hb Sn RK1-1(KX237690.1)和Hb Sn RK1-2(KX237691.1)。2个Hb Sn RK1基因均编码含515个氨基酸且序列高度一致(96.5%)的蛋白质;2个基因均含10个外显子、9个内含子,且外显子大小相近,但基因长度差异明显。在6种橡胶树组织中,2个Hb Sn RK1基因均有表达,但Hb Sn RK1-1在胶乳(产胶细胞乳管的细胞质)中的表达量明显高于Hb Sn RK1-2;在叶片发育不同时期,Hb Sn RK1-1的表达变化不显著,而Hb Sn RK1-2的表达随叶片发育明显下降;在胶乳中,Hb Sn RK1-1的表达显著受乙烯和茉莉酸诱导、受2,4-D抑制,但Hb Sn RK1-2表达受激素处理的影响较小,推测Hb Sn RK1可能参与胶乳再生的激素调控。     

巴西橡胶树6个小G蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

利用笔者实验室建立的橡胶树胶乳EST序列数据库,结合RT-PCR和RACE技术,克隆巴西橡胶树6个小G蛋白基因的cDNA,并以拟南芥小G蛋白家族基因为模板进行进化树分析.结果表明:所克隆的基因分属于小G蛋白的Arf与Rab家族,将其分别命名为HbArfl、HbArf2、HbRab1、HbRab2、HbRab3和HbRab4.氨基酸序列分析发现,HbRab1、HbRab2、HbRab3和HbRab4均具有小G蛋白家族的保守结构域,即4个鸟苷酸(GTP/GDP)结合域、1个效应区和C端半胱氨酸结构域,而HbArf1和HbArf2除在C端无半胱氨酸结构域及效应区序列保守性差外,HbArf1还缺少2个鸟苷酸结合区,HbArf2缺少1个鸟苷酸结合区.     

一个水稻NADPH氧化还原酶相似基因的克隆及表达分析

采用荧光差显(fluorescent differential display,FDD)技术,比较分析了干旱处理与未处理水稻叶片及根中的mRNA表达,并利用H. A. Yellow PAGE(含0.1% H. A. Yellow)再分离与大矩阵(macroarray)筛选相结合的方法,发现1个与拟南芥NADPH氧化还原酶高度相似(96%)的差异片段。该基因的cDNA全长为1423 bp,编码一个具有345个氨基酸残基的多肽。在正常情况下该基因表达量很低,而在干旱处理中高表达。讨论了干旱胁迫下NADPH氧化还原酶基因的可能功能。     

巴西橡胶树多聚遍在蛋白基因的表达分析

研究中发现橡胶树胶乳中的橡胶粒子膜上存在遍在蛋白（Ubiquitin)，天然橡胶就是在橡胶粒子上合成的，一些与橡胶合成相关的酶或蛋白就位于橡胶粒子膜上，为了探讨多聚遍在蛋白（Polyubiquitin)基因在天然橡胶合成中可能的调节作用，对橡胶树Polyubiquitin基因的表达进行了研究，Northern blot分析表明，Polyubiquitin基因在橡胶树叶片，树皮和胶乳中都表达，在胶乳中的表达量比叶片和树皮中的高。用外源乙烯和茉莉酸处理的末开割橡胶树和开割橡胶树进行处理后，均可引起Polyubiquitin基因表达增强，未开割橡胶树对外源乙烯和茉莉酸处理比开割橡胶树的反应敏感。     

用RAPD技术鉴定橡胶树抗白粉病基因连锁标记

用52种RAPD引物对橡胶树11个抗白粉病品系和11个感病品系基因组DNA进行RAPD分析,找到了一个和橡胶树抗白粉病表型密切相关的DNA片段,此片段长390bp,命名为opv—390。opv—390为11个抗性品系所共有和11个感病品系所没有。用ECL(enhanced cheminesence)酶标法标记抗性品系RRIC52(CK)的OPV390为探针,经Southern blot表明,该序列在6个抗性品系中均为单一拷贝或低拷贝,而感病品系皆不含此序列,由此看来,OPV—390可作为橡胶树抗白粉病基因紧密连锁的RAPD标记。这为今后钓取橡胶树抗白粉病基因的工作打下了基础。     

南农87C-38大豆优质11S球蛋白Gy7基因克隆及序列分析

大豆种子不仅富含蛋白质,而且赖氨酸含量较高,利用大豆高赖氨酸基因能够弥补谷类作物种子赖氨酸含量的不足.运用现代分子生物学技术,从高蛋白大豆南农87C-38中克隆11S球蛋白Gy7全基因及cDNA序列.经生物公司测序后,利用vector NTI软件将所克隆的Gy7全基因及cDNA序列与Genbank(AF319776和AF319777)报道的序列进行比对分析,同源性分别为99%和99.6%.序列比对结果显示,Gy7基因cDNA与Genbank报道的序列之间所有的核苷酸差异都位于第3外显子.由此推测,第1、第2和第4外显子编码的氨基酸对于G7多肽形成特定高级结构可能具有非常重要的作用,它们在进化过程中受到的选择压力可能比第3外显子更强.根据遗传密码表推测,克隆的Gy7与Genbank报道的cDNA序列所编码的多肽,两者存在2个氨基酸组成的差异.大豆球蛋白Gy7优质基因的获得为今后利用转基因技术改良水稻、小麦等谷类作物的营养品质奠定了基础.     

菜豆几丁质酶基因的克隆、序列分析及其表达

根据GenBank中收录的菜豆几丁质酶基因mRNA序列设计一对引物,以菜豆品种五常油豆总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个约1.1kb的DNA片段Bchi,将其克隆入pUC18载体.测序和序列分析结果表明,该序列全长1088bp,含有一个981bp的完整开放读码框,无内含子,编码327个氨基酸,编码产物在结构上具有Class Ia几丁质酶的结构特征:N-端具有一个26个氨基酸的信号肽,其后是富含8个半胱氨酸、长41个氨基酸的几丁质结合区和由249个氨基酸组成的高度保守的催化区,C-端为由11个氨基酸组成的液泡定位多肽.序列与结构上的同源性分析表明Bchi基因是菜豆Class Ia几丁质酶基因.此序列已在GenBank中注册,登录号为AY357300.以pQE-30为原核表达载体,构建成pQE-Bchi重组表达载体,转化表达受体菌E.coliM15,经IPTG诱导后表达出一个约35kD的蛋白,与推测的Bchi基因编码产物的大小一致,表明Bchi基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因.     

橡胶树气孔密度与矮生的关系

本文研究气孔密度与橡胶树矮生的关系。试验结果表明:矮生品系气孔密度比正常生长品系小25％左右;矮生品系气孔的长度比正常生长品系的长7.3％,宽度大3.3％。为此,可以正常品系为对照,凭一年的观察结果进行矮生品系的预测。     

橡胶树黑团孢叶斑病发生规律及防治的研究

橡胶树黑团孢叶斑病是我国海南省琼中地区成林橡胶树叶部的主要病害。本文报道黑团孢叶斑病的发生分布情况、流行规律和大田防治试验结果。     

巴西橡胶树大孢子发生和胚囊发育过程的研究

用石蜡连续切片,观察巴西橡胶树胚珠和大孢子发生、胚囊发育过程,结果如下:1.倒生胚珠,胚珠原基在雌蕊心皮来完全愈合成完整子房前产生。珠被发生于造孢细胞末期或大孢子母细胞早期。至二核胚囊期,两层珠被顶部合拢包围珠心。2.具厚珠心,其顶部形成珠心喙;在珠孔上方有珠孔塞,它起源于胚珠附近的胎座组织。2.胚囊发育属于蓼型。发育过程一些明显的变化是:(1)细胞逐渐液泡化;(2)从单核胚囊开始,细胞核连续三次分裂、分化、定位和产生新壁形成七细胞胚囊;(3)出现极性,极性的表现在大孢子母细胞期就开始。4.一些品系的两性花中,雌、雄生殖细胞问各发育阶段有明显的对应关系。     

二个巴西橡胶无性系花药体细胞植株胶乳的生理特性

对生长在系比区内的2个巴西橡胶无性系的花药体细胞植株进行了产量和生理特性的初步观察。试验结果表明,海垦2花药体细胞植株的第一割年的产量高于供体无性系45.2％,与胶乳再生和排胶有关的10项生理参数的分析都显示其具有与高产相适应的生理基础。海垦1花药体细胞植株的产量高于供体无性系20.6％,然而此产量主要是通过胶乳严重长流获得的。此植株胶乳蔗糖和干胶含量极低,胶树对乳管供应蔗糖严重不足,因而胶乳再生极端不良。供体无性系原有的干胶含量偏低和胶乳长流等不良性状在其花药体细胞植株中更为明显。