多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

Separation of type 2 toxins of Vibrio cholerae

Choleragenic toxin was separated from vascular permeability factor by ion-exchange chromatography of supernatants of dialyzed peptone cultures of Vibrio cholerae. The choleragenic toxin eluted from columns of QAE-Sephadex with low-ionicity systems is free of permeability factor activity. Further elution of these columns with 0.5M NaCl removes both the permeability factor and residual choleragenic toxin. When this latter material is chromatographed on columns of carboxymethyl-Sephadex, the permeability factor toxin is eluted by 0.02M phosphate buffer and is free of choleragenic activity. Therefore, choleragenic and permeability factor activities of the type 2 cholera toxins are different and can be separated by these procedures.     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

Molecular architecture and assembly principles of Vibrio cholerae biofilms

In their natural environment, microbes organize into communities held together by an extracellular matrix composed of polysaccharides and proteins. We developed an in vivo labeling strategy to allow the extracellular matrix of developing biofilms to be visualized with conventional and superresolution light microscopy. Vibrio cholerae biofilms displayed three distinct levels of spatial organization: cells, clusters of cells, and collections of clusters. Multiresolution imaging of living V. cholerae biofilms revealed the complementary architectural roles of the four essential matrix constituents: RbmA provided cell-cell adhesion; Bap1 allowed the developing biofilm to adhere to surfaces; and heterogeneous mixtures of Vibrio polysaccharide, RbmC, and Bap1 formed dynamic, flexible, and ordered envelopes that encased the cell clusters.     

Small molecule-induced allosteric activation of the Vibrio cholerae RTX cysteine protease domain

Vibrio cholerae RTX (repeats in toxin) is an actin-disrupting toxin that is autoprocessed by an internal cysteine protease domain (CPD). The RTX CPD is efficiently activated by the eukaryote-specific small molecule inositol hexakisphosphate (InsP6), and we present the 2.1 angstrom structure of the RTX CPD in complex with InsP6. InsP6 binds to a conserved basic cleft that is distant from the protease active site. Biochemical and kinetic analyses of CPD mutants indicate that InsP6 binding induces an allosteric switch that leads to the autoprocessing and intracellular release of toxin-effector domains.     

红茶菌和中草药红茶菌体外抑制霍乱弧菌的研究

[目的]研究红茶菌和中草药红茶菌在体外对霍乱弧菌的抑制作用。[方法]采用试管稀释法(MIC),研究红茶菌与中草药红茶菌对霍乱弧菌的体外抑制作用。[结果]红茶菌与中草药红茶菌对霍乱弧菌都具有一定的抑菌作用,尤其是中草药红茶菌原液对高浓度的霍乱弧菌具有显著的抑菌作用。[结论]与红茶菌相比,中草药红茶菌对霍乱弧菌具有显著的抑菌作用,在临床上可用于对霍乱弧菌感染的预防。     

拮抗霍乱弧菌菌株枯草芽孢杆菌YB-99的筛选及在水产养殖中的应用

[目的]筛选和研究拮抗霍乱弧菌菌株,为水产养殖业中弧菌病生物防治提供思路,对促进水产养殖的绿色生态持续发展具有重要意义.[方法]通过滤纸片法和共培养法筛选到1株高效拮抗霍乱弧菌的菌株枯草芽孢杆菌,并将其应用于南美白对虾养殖中,观察其对水产养殖池水体霍乱弧菌的拮抗效果.[结果]共培养复筛试验中,枯草芽孢杆菌YB-99与霍...     

泉州市部分海产品中霍乱弧菌的实时荧光定量PCR检测及分析

对泉州市某区海产品中的霍乱弧菌进行实时荧光定量PCR检测,经特异性试验表明:该方法能选择性检测O1和O139群霍乱弧菌,而且特异性好、灵敏度高,能有效克服假阳性,结合传统的病原微生物培养方法,可用于临床检验及卫生检测。检测结果显示,该次送检海产品检出的2例O1霍乱弧菌均无毒力基因ctx,但仍需加强监测,预防散发和暴发流行。     

霍乱弧菌中弧菌素合成酶VibF的A结构域基因的克隆、表达与纯化研究

弧菌素合成酶的A结构域在弧菌素的合成过程中发挥着重要作用。使用DNAStar软件对A结构域的蛋白质二级结构进行预测,截取了多组不同氨基酸长度的A结构域片段。使用PCR方法从霍乱弧菌N16961的基因组中克隆了A结构域基因,通过酶切、连接等方法将其构建到表达载体pET-21b(+)上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达。在30个不同氨基酸长度的A结构域蛋白片段中获得5个可溶性表达的片段;并且通过三步分离纯化的方法获得了一性状良好、均一和高纯度的A结构域蛋白(N861-1410),从而为A结构域蛋白质晶体生长提供了基础。     

运用体内表达技术筛选霍乱弧菌感染成年小鼠体内诱导表达基因

为研究霍乱弧菌体内感染机制,寻找新的抗霍乱药物靶标和候选疫苗。以转座子上无启动子的kan-rpsL融合基因作为体内外双重抗生素报告基因,通过与霍乱弧菌埃尔托型C6706接合建立转座子突变库,经体内外各两轮筛选,获得对卡那霉素(Kan)体内抗性体外敏感、链霉素(Str)体外抗性体内敏感的突变株,即转座子插入位点上游包含了能够在体内被诱导激活的启动子。初步建立了筛选霍乱弧菌体内诱导表达基因的成年小鼠模型,最终获得5株阳性克隆。对转座子插入位点进行序列分析,分别为编码渗透敏感型钾离子通道组氨酸激酶的kdpD,谷氨酸合酶大亚基的gltB1,亮氨酰氨基肽酶的pepB以及核苷渗透酶的nupC。对kdpD基因融合lacZ报告基因进行表达调控研究,发现该基因在LB和霍乱毒素诱导培养基AKI中不能被诱导表达。以上结果表明霍乱弧菌通过调节氨基酸及核酸代谢,感知体内外环境来适应宿主体内环境的变化。     

Chitin in sea anemone shells

Chitin, which is widely distributed among life forms, is well documented in the coelenterate class Hydrozoa and is contained in one member of class Scyphozoa. In class Anthozoa, hard corals synthesize it but soft corals do not. Chitin was identified by infrared spectrophotometry in the trochoid shell of the actinian Stylobates. It constitutes 1.7 percent of the shell by weight, the rest probably being protein. The ability of sea anemones to synthesize chitin is there by confirmed.     

几丁质/壳聚糖及其衍生物在食品工业中的应用

几丁质/壳聚糖由于其独特的分子结构而具有很多特殊功能。几丁质/壳聚糖及其衍生物在食品、纺织、印染、造纸、医药、农业、环保、化工等行业有着广阔的应用。在食品工业中,可作为保健食品基料、抗菌剂、果蔬保鲜剂、液体食品的澄清剂、食用包装膜、食品废水处理、饮用水净化剂、固定化酶载体、食品加工剂、霉菌污染检测、肉制品抗氧化剂等。     

几丁质和壳聚糖在农业领域的应用

几丁质、壳聚糖已经被广泛应用于农业领域。综述了它们在保鲜作用、饲料添加剂、动物医药、病虫害防治、植物生长调节剂、土壤改良剂和肥料等方面的应用。     

昆虫几丁质合成酶基因转录调控研究进展

几丁质广泛存在于真菌、昆虫和甲壳类动物中,但不存在于植物和脊椎动物中,为昆虫外骨骼、气管及中肠围食膜的重要组分。昆虫蜕皮过程中,富含几丁质的结构需重建以完成虫体扩张,这一过程中需要严格控制几丁质的合成。因此,几丁质生物合成一直是害虫控制的重要靶标。随着昆虫种群耐药性的迅速发展,害虫防控面临新的挑战,需要不断寻找新的害虫防治靶点,以开发新型杀虫剂,实现害虫的有效防控。几丁质合成酶（Chitin synthase,CHS）为昆虫几丁质合成途径的关键酶,在几丁质合成中发挥重要作用。昆虫存在 CHS1 和 CHS2 两类几丁质合成酶,CHS1 在昆虫外骨骼及气管中表达,催化几丁质合成,CHS2 则主要负责中肠围食膜的几丁质合成。昆虫 CHS1 基因受干扰后可导致虫体表皮产生缺陷,背气管干发育异常,而 CHS2 基因受到抑制后则往往会导致虫体中肠变短,体重下降。两类 CHS 基因下调均可引起昆虫大量死亡。昆虫体内具有复杂的 CHS 转录调控机制以保证其正常生长发育和应对外界刺激。根据国内外研究,该文综述了昆虫 CHS 基因转录调控研究进展,包括昆虫激素、转录因子、表皮损伤及进食刺激、几丁质代谢相关基因及物质、microRNA 以及几丁质合成抑制剂等对昆虫 CHS mRNA 水平的影响,为将来开发和利用以 CHS 为靶标的绿色农药防治害虫提供理论依据。     

几丁质触发植物免疫的研究现状与展望

真菌病害是植物病害中最为严重的一种,世界上70%—80%的植物病害都是由真菌引起。几丁质是病原真菌细胞壁的重要组成成分,是一种典型的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）。当植物受到病原真菌入侵,位于细胞膜上的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）能够直接与几丁质及其寡糖相互作用并触发植物的免疫反应。近几年,随着植物几丁质受体的成功鉴定,其与几丁质的相互作用机制以及几丁质触发植物免疫的分子机理被广泛研究,并取得了许多重要进展。为了较全面、系统地反应几丁质触发免疫研究的历史沿革、研究现状和发展趋势,笔者就植物对几丁质的识别机制、信号转导以及病原真菌对几丁质触发的免疫反应的抑制机制这3方面进行了综述,并对未来研究的发展方向进行了探讨。     

甲壳素脱乙酰酶在壳聚糖制备中的应用进展

作为一种资源极其丰富的天然高分子化合物,甲壳素的研究与开发受到各国的普遍重视,其经脱乙酰化的产物－壳聚糖因具独特的物化及生物学特性而被广泛应用。而采用甲壳素脱乙酰酶能制备出性能独特的壳聚糖。本就甲壳毒脱乙酰酶在壳聚糖制备中的应用及研究进展作一综述。     

论英语交际性阅读能力的培养

交际性阅读能力的培养包括阅读速度、技巧的训练和理解能力的培养.当然,这些训练和培养并非一朝一夕之功,而是要从头抓起,持之以恒,不能有丝毫的松懈.