福建省某规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒多样性分析

为了解福建省某规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况和基因变异情况,从该猪场采集9份疑似感染PRRSV的猪病料进行病毒分离及分离毒株ORF5、ORF7基因扩增。结果显示,所测9个PRRSV中仅W9-2和W9-3等2株的ORF5、ORF7的核苷酸序列同源性均为100%,其他7个毒株(C1-3、C4-6、C7-9、C10-13、W7-2、W7-4和W10-1)的ORF5、ORF7核苷酸序列同源性分别为83.3%~99.2%和88.4%~100%,与参考毒株核苷酸同源性分别为78.3%~96.2%和87.9%~99.7%,表明规模化猪场至少存在8种毒株。基于ORF5和ORF7序列构建的遗传进化树显示,C1-3、C4-6、C7-9和C10-13等4个毒株为来源于NADC30-like PRRSV与HP-PRRSV的重组毒株,而W7-2、W7-4、W9-2、W9-3和W10-1等5个毒株属于NADC30-like PRRSV。说明该规模化猪场存在多种PRSSV毒株,给该猪场防控PRRS带来严峻挑战,研究结果可为PRRS的防控和新型疫苗的研究提供参考。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析

为了解河北省猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况及毒株遗传变异趋势,应用RTPCR方法,对河北省10个地区的18个发病猪场进行调查,分别扩增出23株缺失部分NSP2基因和完整ORF5基因的毒株。序列分析结果显示,23株PRRSV NSP2基因均缺失了不连续的30个氨基酸,从而证实河北省存在美洲型PRRSV变异株的流行。23株PRRSV ORF5核苷酸序列与国内外已发表的基因序列绘制的遗传进化树表明:20个毒株与JXA1形成一个基因亚群;而另3个毒株与NADC30毒株形成一个基因亚群,并且变异最大,是以后的主要临床研究对象。推导编码氨基酸的比较结果表明,河北省流行的PRRSV毒株ORF5基因编码蛋白已发生较大变异,需在今后临床诊断与疫苗防控中引起重视。     

贵州省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

为了调查猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异情况,笔者收集了贵州省16家规模化养殖场153份疑似PRRS的样品,通过RT-PCR检测和ORF5基因序列的测定,结果表明:所有样品之间ORF5基因的同源性为98.7%～100%,氨基酸的同源性为98.5%～100%;与美洲型代表毒株VR-2332、国内标准毒株CH-1a和欧洲型代表毒株LV基因序列的同源性分别为89.2%～90%、94.8%～95.6%、59.7%～60.2%,氨基酸序列同源性分别为88.8%～89.3%、92.7%～94.2%、54.9%～55.3%,遗传衍化关系分析表明流行毒株属于美洲型.ORF5基因发生离散性变异,可以分为3个簇,与中国其他地区分离的高致病性PRRS病毒关系密切,而与早期分离的PRRS毒株关系疏远,说明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因存在变异现象.     

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株（HP-PRRSV）;3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株（HP-PRRSV）为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白7真核表达及亚细胞定位

【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)非结构蛋白7 (nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank数据库中NSP7基因序列合成目的基因并构建真核表达载体P3×FLAG-CMV-NSP7,瞬时转染Marc-145细胞后通过Western blotting验证蛋白表达,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)对NSP7蛋白进行亚细胞定位,利用生物信息学分析软件预测NSP7蛋白的理化性质、结构及功能。【结果】成功构建P3×FLAG-CMV-NSP7真核表达载体;Western blotting结果显示,获得大小约为2.7 ku的目的条带,证实重组载体在Marc-145细胞中高效表达。IFA结果证实在PRRSV感染初期NSP7蛋白大部分分布于细胞质中,随着感染时间延长NSP7蛋白由细胞质进入细胞核。生物信息学分析结...     

湖南省4株猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列测定与分析

为了解湖南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,对湖南省2016—2019年分离的4株PRRSV(Hunan/2016/075、Hunan/2017/085、Hunan/2018/123、Hunan/2019/055)进行全基因组测序,对其ORF5、NSP2基因以及全基因组核苷酸序列进行分析。结果显示,分离的4株病毒株均为美洲型,全基因组同源性为83.1%～98.7%,其中3株属于高致病型,1株为属于类NADC30型。Hunan/2016/075、Hunan/2017/085毒株全长序列与谱系5中亚系5.1的代表性毒株BJ-4亲缘关系相近,聚为一簇;Hunan/2018/123毒株与谱系8.7中的tjnh1501毒株聚为一簇;Hunan/2019/055毒株独立成一簇,与谱系1亲缘关系相近。本研究掌握了湖南省PRRSV的遗传变异情况,从而为制定有效的防控策略提供了依据。     

临床健康猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株存在情况调查与分析

对华南地区152个规模场和102个个体养殖场/散养户临床健康猪群的2934份血清样品进行PRRSV变异株(NSP2 1594-1680 bp缺失)核酸检测,结果阳性49份,阳性率为1.67%。总计254个场(户)中18个PRRSV变异株核酸阳性,场(户)阳性率为7.09%。其中152个规模场中5个阳性,场阳性率为3.3%;102个个体养殖场/散养户中13个阳性,场(户)阳性率为12.8%。结果表明PRRSV变异株(NSP21594-1680 bp缺失)在华南地区各种类型猪场中都存在,其中在个体养殖场/散养户中存在的几率高于规模猪场。提取来源于1个规模场和2个个体养殖场3份阳性样品核酸进行PRRSV NSP2部分基因序列测定和分析,所获得的氨基酸序列与CH-1a、VR-2332等经典美洲型毒株相比,均在481位缺失1个氨基酸,在532-560位连续缺失29个氨基酸,与2006年以来国内分离的高致病性猪蓝耳病病毒JXA1、HUN4、HPDEBV等具有相同的缺失特性。鉴于PRRSV变异株(NSP2 1594-1680 bp缺失)在生产中已造成很大损失,各养殖生产场必须强化以有效免疫、消毒、生物安全措施为主的综合防控工作。     

河北省2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析

为了解2010年河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒变异趋势,用RT—PCR方法对2010年河北省发病猪场的病料进行PRRSV Nsp2和0RF5基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar软件对所测序列进行分析。结果显示,扩增的Nsp2基因氨基酸序列相似性为91．4％～98．8％,与GenBank中参考毒株的氨基酸序列相似性为6...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南分离株ORF5基因的遗传进化分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在湖南省地方猪保种场的感染情况,本研究在2019－2020年间从湖南省2个地方猪保种场采集287份全血样品。首先将血样混合成41份,采用RT-PCR或PCR法进行PRRSV病原检测,进一步通过高保真PCR扩增从PRRSV阳性样品中扩增PRRSV ORF5基因;测序后利用DNAStar软件分析获得的ORF5基因及其编码的GP5氨基酸与国内外不同PRRSV毒株的遗传进化关系;最后用PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞,经盲传分离毒株,并用Reed-Muench法测定病毒滴度。结果显示,检测的41份混样中有3份PRRSV病原核酸呈阳性;从PRRSV阳性混样中单独扩增获得6条PRRSV ORF5基因序列,均属于PRRSV-2型的lineage 8分支,相似性为99.2%~99.8%;6条ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在信号肽区域（第23位）、潜在的N-糖基化位点（第33位）和表位C （第59位）存在差异;PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞盲传5代后出现明显的细胞病变,获得1株PRRSV毒株,命名为NX-1,病毒TCID₅₀为4×10⁵/mL。本研究表明,湖南省地方猪保种场存在PRRSV感染,感染的PRRSV属于PRRSV-2型的lineage 8,其GP5氨基酸序列存在的多处变异可能是造成疫苗免疫失败的原因之一,以上结果可为湖南省地方猪保种场的免疫防控提供一定参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒特殊变异株LD812的分离与序列分析

从2008年送检的病猪病料中分离到1株致细胞病变代次、时间以及细胞病变形态与典型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)培养特性不同的PRRSV(LD812株)。对LD812株的Nsp2和ORF5基因进行测序发现,该株病毒与标准HP-PRRSVJXA1株(与VR2332相比,JXA1Nsp2基因的第478、538～566位氨基酸缺失,缺失形式为1+29个氨基酸)的Nsp2基因同源性为98.3%,LD812分离株Nsp2基因上第475～520和538～566位氨基酸缺失,缺失形式为46+29个氨基酸,比JXA1株在1号缺失位多缺失45个氨基酸;LD812株ORF5基因序列与JXA1株相比仅有8个核苷酸的点突变。结合该毒株的临床特征、细胞培养及分子特性,推测LD812为一弱毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中随机选取25株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的全基因序列进行同源性分析并构建了基因进化树,同时对PRRSV ORF7基因序列进行遗传变异分析,发现PRRSV美洲株之间或欧洲株之间的ORF7基因相对保守,但美洲株和欧洲株的ORF7基因的核苷酸及氨基酸同源性较低.说明建立的针对N蛋白的多种检测方法在高致病性PRRSV肆虐的现今仍具有实用性.     

2018年四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的分子流行病学调查研究

为研究四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行及进化趋势,本研究以GP5蛋白为研究对象,对2018年间收集的378份四川省不同区市县PRRSV疑似病料进行了实时荧光定量PCR检测,并对部分毒株ORF5基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行进化分析和N-糖基化位点预测。通过疑似病料实时荧光定量PCR检测,共检出阳性样品69份,阳性率为18.25%。对其中23株PRRSV的ORF5基因序列分析结果显示,ORF5基因之间核苷酸同源性为81.6%~100%,推导的氨基酸同源性为81.4%~100%,均属于美洲型毒株。其中,1株属于以经典毒株VR2332为代表的亚型Ⅰ,17株属于以高致病毒株JXA1为代表的亚型Ⅱ,5株属于重组毒株NADC30为代表的亚型Ⅲ,说明2018年间四川省PRRSV流行毒株存在基因多样性,HP-PRRSV依然是主要流行毒株,但仍存在不断进化的经典毒株,同时,类似NADC30和QYYZ的重组毒株也开始出现。通过氨基酸突变位点和N-糖基化位点分析发现,23株PRRSV在GP5两个重要抗原表位相关区域和毒力相关位点均发生了一定程度的突变,推测这些突变可能影响了病毒逃避机体免疫和病毒毒力,提示在PRRSV防控中,应该加强遗传进化分析,根据不同类型的毒株选择有针对性的疫苗和防控策略。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF3基因的克隆及变异分析

从河北唐山分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为TS株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF3基因,将扩增产物连接到pMD19-T载体并转化克隆菌,将阳性重组质粒PMD-GP3进行序列测定与分析。应用DNA Star软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株的ORF3基因进行序列比较,并绘制系统进化树。这为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒柳州地方株NSP2和ORF5基因变异分析

为了给广西柳州预防和控制猪繁殖与呼吸综合症提供理论数据,本研究对利用RT-PCR方法扩增了该地区流行株LZ5和LZ6的NSP2和ORF5基因并进行测序分析,然后与GenBank中已发表的PRRSV毒株的NSP2和ORF5基因序列进行比较。结果显示,2株柳州地方流行株均属于美洲型,在NSP2基因第483位和535~563位氨基酸均存在30个氨基酸的不连续缺失,其NSP2和ORF5基因的核苷酸同源性分别为99.5%和99.7%,推导的氨基酸同源性分别为100%和99.5%;与近几年国内流行的高致病性蓝耳病代表性毒株之间的NSP2、ORF5基因核苷酸同源性分别为94.7%~96.2%和97.2%~98.0%,其推导的氨基酸同源性分别为92.0%~95.5%和94.5%~97.0%。序列分析结果表明此次柳州流行的PRRSV与2006年夏高热病引起的基因序列高度同源,在基因序列上并未显示出新的特性,在国内也缺乏明显的地域性差异。     

2015-2016年我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学调查

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪的一种重要的病原,给全球养猪业造成重大的经济损失。本研究采集2015-2016年我国12省市362份临床发病猪肺脏病料用RT-PCR检测RRRSV,结果有191份为阳性,阳性率为52.8%。34个毒株ORF5基因测序结果表明,所有的毒株均属美洲型,分为4个亚型,其中2个毒株形成一个新的亚型Ⅳ;6个毒株与美国NADC30株有高度同源性,形成了亚型Ⅲ。研究表明我国PRRSV毒株存在遗传多样性,为猪繁殖与呼吸综合征的防治提供了理论依据。     

2016-2017年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子检测及NSP2、ORF5基因变异分析

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在广东流行毒株的分子遗传变异情况和发展趋势,通过RT-PCR方法,对2016—2017年采自广东省各地906份疑似病料进行PRRSV检测,并对其中9株PRRSV的NSP2和ORF5基因进行测序及遗传变异分析。结果显示,有399份样品被检出为阳性,阳性率达到44%;通过NSP2和ORF5基因序列比对和遗传进化分析,发现广东流行毒株主要为美洲型PRRSV,且全部9株与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)高度同源;其中7株的NSP2蛋白存在与HP-PRRSV相同的1+29个氨基酸的不连续缺失特征;9株GP5蛋白的2个重要抗原相关区域的氨基酸位变化特征与HP-PRRSV一致,与美洲型代表株VR-2332相比变异明显。结果表明,PRRSV在广东流行的情况仍比较严重,当前HP-PRRSV依然是广东的优势病毒株,提示对PRRSV的流行和变异进行持续监测是有必要的,还应加强对其致病机理和新型疫苗研发等的深入研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株NSP2基因的序列分析

为了分析河北省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) NSP2基因的变异情况,试验对2009年采自秦唐部分地区和廊坊地区的临床发病猪肺组织提取RNA,通过RT - PCR扩增样本中PRRSV的NSP2全序列,并对其进行生物信息学分析,应用DNAStar软件将其与VR -2332、CH - la、MLV、BJ -4、...     

新疆阿克苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株致病性分析

本文选择新疆阿克苏地区猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪为研究对象,对分离株进行病毒分离、基因序列分析等工作,对8个PRRSV毒株NSP2基因序列的测定和比较,找出病毒的变异区。研究结果显示：XJNJ-1-1、XJNJ-1-3、XJNJ-6-2和XJNJ-6-3毒株为PRRS高致病性毒株,XJNJ-7-1、XJNJ-7-2、XJNJ-10-2和XJNJ-15-3毒株为低致病性毒株。说明新疆阿克苏既存在PRRS高致病性毒株,也存在PRRS低致病性毒株。