云南省水稻稻瘟病菌无毒基因AVR-Pia变异及水稻抗性基因Pia的有效性

为进一步了解田间稻瘟病菌Magnaporthe oryzae群体中AVR-Pia基因的分布及变异,利用水稻单基因系IRBLa-C水稻品种对自云南省13个市(州)采集分离得到的471株稻瘟病菌菌株进行抗性基因Pia有效性测定;利用无毒基因AVR-Pia特异性标记对471株稻瘟病菌菌株进行PCR检测和测序,并分析稻瘟病菌群体中无毒基因AVR-Pia的分布及DNA结构变异;利用有效性结果和PCR检测结果对471株菌株进行反应型划分,筛选鉴定菌株;利用鉴定菌株对云南省112份地方稻种进行Pia基因鉴定。结果表明,在471株稻瘟病菌菌株中,对含有Pia基因的水稻单基因系IRBLa-C表现为抗病和感病的菌株数分别为139株和332株,所占比例分别为29.5%和70.5%;在471株稻瘟病菌菌株中,分别有244株和227株菌株含有无毒基因AVR-Pia和不含有无毒基因AVR-Pia,所占比例分别为51.8%和48.2%,无毒基因AVR-Pia主要为完全缺失变异;在471株稻瘟病菌菌株中,A-和V+反应型菌株数分别为56株和161株,共217株,占总菌株数的46.1%,在13个市(州)稻瘟病菌群体中,A-和V+反应型菌株所占比例差异较大,其中在普洱市、红河哈尼族彝族自治州、昭通市、玉溪市4个市(州)的比例较大,分别为77.8%、57.1%、52.1%和50.0%;在112份云南省地方稻种质资源中,有20份地方稻品种含有抗性基因Pia,主要分布在9个市(州)中。表明云南省13个市(州)绝大部分水稻产区水稻Pia基因已丧抗性,含Pia基因的水稻种质在云南省分布较广。     

水稻品种抗病性变化与稻瘟病菌致病性变异的相关效应研究

 根据1979~1992年对四川省稻瘟病菌致病性与水稻品种抗病性的监测结果表明:稻瘟病菌种群变异与水稻品种抗病性变化密切相关。潜在致病小种随水稻种植面积比率的扩大而增殖,最后成为优势小种。     

水稻受稻瘟病菌诱导的一个基因片段的分离和克隆

 本研究利用一对抗瘟性近等基因系(near-isogenic lines,NILs) H7R (抗病)和H7S (感病),经稻瘟病菌诱导后提取RNA,进行m RNA差异显示(differentialdisplay,DD)。在获得多个差异cDNA片段的基础上,经PCR重扩增,Southern杂交粗筛,Northern进一步鉴定。其中25号片段(克隆RM a25)经序列测定,国际联网查询,证实是受稻瘟病菌诱导的水稻新基因cDNA片段。     

稻瘟病菌有性世代及色素的基因表达分析

利用分离自陆稻的稻瘟病菌菌株９４－８４ｃ（ＭＡＴ１－１）和９５－２３４－ａ（ＭＡＴ１－２）进行有性杂交,得杂交组合６３１５;利用本实验室子囊孢子菌株６３１５Ｒ－１１（ＭＡＴ１－１）与中国水稻所提供的６０２３菌株（ＭＡＴ１－２）杂交得组合７３６８;６３１５Ｒ－３１（ＭＡＴ１－１）,与９５－２３－４ａ（ＭＡＴ１－２）杂交得组合７３７０;     

水稻品种抗稻瘟病分析及基因聚合抗性改良

为了解水稻品种抗瘟性及基因聚合改良的情况,通过喷雾和离体划伤接种法对黑龙江省20个水稻品种和16个外源抗瘟基因的抗性频率及6个主要水稻品种含有的抗瘟基因型进行了分析。结果表明,20个水稻品种抗性频率介于10.89%~68.32%之间,垦稻12抗性最低,龙粳40抗性最高;16个抗瘟基因抗性频率介于0~50.50%之间,Pi-sh、Pi-19和Pi-k~m基因抗性最低,Pi-z~t抗性最高;在联合抗病性方式下,龙粳40龙粳31和龙粳40龙稻14组合抗性改良效果略好;20个水稻品种的抗性相似系数介于0.24~0.75之间,在0.40水平上将其划分为5个类群;6个水稻品种共检测到抗瘟基因11个,Pi-1基因出现频率最高;在基因聚合方式下,龙粳39聚合后抗性最高,龙稻13聚合后抗性升幅最大。综合分析,供试水稻品种及单基因系品种抗性表现较差,基因聚合方式对水稻品种的抗性改良效果明显优于联合抗病性方式。     

哈尔滨地区抗瘟基因抗性分析及水稻品种抗性评价与利用

为明确哈尔滨地区24个抗瘟基因的抗性和20个水稻品种含有抗瘟基因型的情况,选取200个稻瘟病菌单孢菌株和22个已知无毒基因的鉴别菌株作为鉴定系统,通过喷雾法和离体划伤法接种,应用PCR技术对部分试验结果进行了重复性检测,并在此基础上进行了抗性布局分析。结果表明:24个抗瘟基因抗性差异较大,抗谱在11.00%~93.00%之间,平均抗谱38.29%;抗谱超过80.00%的基因有3个,由高到低为Pi-9、Pi-ta2和Pi-z5;抗谱低于20.00%的基因有9个,分别为Pi-a、Pi-ks、Pi-i、Pi-t、Pi-kp、Pi-ta、Pi-3、Pi-km和Pi-sh,Pi-a抗性最差。20个水稻品种中检测到抗瘟基因13个,共出现40次,其中Pi-a和Pi-19各出现6次,频率最高;龙稻5含抗瘟基因最多,4个,分别为Pi-ks、Pi-1、Pi-19和Pi-sh。在哈尔滨晚熟稻区建议布局绥粳8、中龙香粳1或者绥粳8+中龙香粳1搭配;在早熟稻区建议布局龙粳18、哈香07-321或者龙粳18+哈香07-321搭配。     

PWL基因家族在黑龙江省水稻稻瘟病菌中的分布与变异

根据已公布的PWL家族基因序列设计4对特异性引物, 对329个采自2016年及2017年黑龙江省各稻区的水稻稻瘟病菌单孢菌株DNA进行PCR扩增与序列分析, 研究了水稻稻瘟病菌中PWL家族基因的组成及变异特征?结果显示, PWL2与PWL4在黑龙江省各稻区稻瘟菌中均有分布且稳定存在, 出现频率分别为73.86%与73.25%; PWL3出现频率为40.73%; PWL1在329个菌株DNA中均未扩增出目的条带, 再次验证了PWL1在水稻的稻瘟病菌中显示为完全缺失?对部分菌株的PCR产物进行测序分析发现, PWL2?PWL3和PWL4基因编码区在黑龙江省水稻稻瘟病菌株中的主要变异为点突变, 且引起氨基酸的突变?     

稻瘟病菌MoCOS1基因调控MoCMR1基因表达的研究

 以往研究证明MoCOS1可能是一个新型的转录因子,其突变体不产生分生孢子,黑色素合成明显减少。经过RNA-Seq分析,发现受MoCOS1调控的基因达到442个,其中MoCMR1的表达水平受到MoCOS1的下调。本研究中通过实时定量PCR进一步证实MoCOS1基因突变导致MoCMR1基因表达水平下降。基因MoCMR1突变后,黑色素产量略有减少,但分生孢子形态及产量和MoCOS1的表达量没有发生变化。     

花鼠乳酸脱氢酶C基因cDNA的克隆、分析及原核表达

为研究花鼠乳酸脱氢酶C(lactate dehydrogenase C,LDH-C)对花鼠免疫不育控制的影响,以花鼠睾丸c DNA为模板,通过RT-PCR技术得到花鼠LDH-C基因c DNA编码区,并进行序列分析,构建花鼠LDH-C的原核表达载体,导入到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果显示:扩增出的c DNA片段为999 bp,编码332个氨基酸,含有完整的开放阅读框;负电荷残基与正电荷残基均为36个;预测蛋白质分子量为37k D,理论等电点为7.04,无信号肽和跨膜区,推测其是一种非分泌、疏水性蛋白。α螺旋、无规则卷曲以及延伸链是s LDH-C蛋白二级结构的主要成分。重组菌在IPTG诱导下获得了约37 k D带有His-Tag的目的蛋白。     

部分水稻栽培品种对稻瘟病的抗性分析及利用评价

把采集、分离自云南省 5个稻作区的 89个稻瘟病菌分生孢子单孢菌株及本实验分离的 280多个子囊孢子单孢菌株 ,共 108个生理小种 ,接种于当地 10个主栽水稻品种上。根据不同菌株在各个水稻品种上的毒力频率及品种两两配合后的联合致病系数 ,明确云粳 34号、云粳 42号、腾糯 2号、楚粳 17号抗瘟性较强。在108个生理小种中 ,其毒力频率分别仅为1.93%、2.75%、9.43%和16.76% ,仍可在本省继续推广种植或作抗源使用 ;而合系35、鹤16、楚粳3号、楚粳 14号、云粳 9号、云粳136号的毒力频率值分别为23.99%、25.88%、42.32%、86.35%、57.84%和41.08% ,已不能在云南单一大面积推广种植。试验表明 ,在利用分生孢子菌株作抗性分析 ,同时辅助于子囊孢子 ,将可提高抗性分析的准确性     

三环唑和多菌灵对水稻抗病品种与水稻稻瘟病菌互作的影响

分析了三环唑和多菌灵对水稻稻瘟病毒力及对品种抗病性的影响,结果表明三环唑和多菌灵对水稻品种与稻瘟病菌互作有重要影响。当喷雾0.2μg/mL三环唑于13个日本已知抗性基因品种时,原对ZE₃和ZG₁混合菌株表现抗性的爱知旭表现感病,当喷雾2μg/mL三环唑时,爱知旭则表现抗病,而在0、0.2μg/mL三环唑时均表现抗病的露明则在2μg/mL三环唑时表现感病;喷雾0.2μg/mL多菌灵于13个日本已知抗性基因品种时,ZB₁、ZE₃、ZG₁混合菌株在0μg/mL多菌灵时表现抗性的爱知旭则表现感病,当多菌灵浓度为2μg/mL时,露明又表现为抗病,而在0、0.2μg/mL多菌灵时,对ZG₁表现为抗病的草笛则表现感病;13个已知抗性基因品种中其他品种在使用了三环唑和多菌灵后抗性也发生了变化,这说明稻瘟病菌的分布和组成与这类杀菌剂的长期使用可能有一定关系。     

一个新的与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pikm紧密连锁的SCAR标记

 无毒基因是病原物中决定寄主抗病性表达的功能基因,其功能的丧失导致毒性小种的产生。本研究利用随机引物扩增DNA多态性技术,从稻瘟病菌菌株S1522中新筛选到1个与无毒基因AVR-Pik^m紧密连锁的DNA标记OPE12₁₄₀₀。根据OPE12₁₄₀₀的核苷酸序列,设计了1对含有17个核苷酸的特异性SCAR引物,并利用该引物对无毒表型亲本S1522和毒性表型亲本S159及其有性杂交后代的108个菌株进行了PCR扩增。结果表明:所有无毒表型的菌株均能特异性扩增出1条与OPE12₁₄₀₀大小相近的DNA片段,而毒性表型的菌株除2个重组体外,均不能扩增出此片段。根据计算,这一SCAR标记与目标无毒基因AVR-Pik^m之间的遗传距离为1.89 cM,与本研究小组先前报道的另一个标记OPO12₁₀₀₀位于目标基因的同一侧,但与OPO12₁₀₀₀相比,距目标基因近了2.86 cM。本标记的获得将有助于确定AVR-Pik^m在染色体上的位置,有助于确定用于进一步筛选位于相反一侧的连锁标记的重叠群区域。     

2000-2005年辽宁省稻瘟病菌种群动态分析

2000-2005年6年间,共分离测定了辽宁省稻瘟病菌411个单孢菌株,经7个中国鉴别品种鉴定,结果划分为7群36个生理小种,在辽宁省流行的优势种群为ZF群和ZE群,近年来致病性强的籼型种群ZA出现频率增加,致病性弱的粳型种群ZF出现频率下降,2001年导致抚9621水稻抗瘟性丧失的ZA₂₅小种2005年又重新出现,上世纪90年代初表现优势的ZG群小种2005年没有检测到。     

稻瘟病菌在水稻CO39近等基因系上的生命表和繁殖表

 本文选用以CO39为背景的水稻近等基因系与广东省稻瘟病菌3个优势生理小种(ZC₁₃、ZB₁和ZB₅)构成12个亲和性和非亲和性互作组合,组建各组合稻瘟病菌的生命表和繁殖表,分析在亲和性互作中稻瘟病菌的生存和繁殖状况对寄主发病的影响,并探讨在非亲和性互作中抗性基因在抵御病菌侵染过程中的作用。结果表明,在亲和性和非亲和性互作中,稻瘟病菌生长繁殖各阶段均参与了感抗反应并发挥了一定的作用:在CO39近等基因系上,同一小种的孢子萌发率或菌丝形成率无明显差别,而小种间则表现一定差异;病菌的定殖和繁殖是亲和与非亲和互作的关键阶段,定殖率、病斑形成率低,则寄主表现抗病,反之则表现感病。在繁殖表众多表示种群增长的参数中,世代平均产孢量F'、净增殖率R₀、最大相对增长率r_max和种群趋势指数Ⅰ等4个指标适合于反映稻瘟病菌繁殖状况与感抗病反应的关系。     

水稻遗传多样性田间稻瘟病菌生理小种研究

 采用7个中国稻瘟病菌鉴别品种,将来自2000年云南省石屏县水稻品种净栽和混栽田块的62个稻瘟病菌株鉴定为7群15个小种。其中,来自净栽黄壳糯田块的10个菌株被鉴定为4个种群,来自净栽汕优63田块的28个菌株鉴定为3个种群,来自汕优63/黄壳糯混栽田块的24个菌株鉴定为6个种群。本实验结果表明,混栽田块稻瘟病菌生理小种类型比净栽田块丰富,证明了水稻品种多样性种植有利于稻瘟病菌稳定化选择。     

一个与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik~m连锁的SCAR标记的分离

 本研究将以前在稻瘟病菌菌株S1522获得的与决定对水稻品种梅雨明无毒性的基因(AVR-Pik^m)相连锁的1个RAPD标记OPO12₁₀₀₀进行了克隆和鉴定。核苷酸序列测定与分析结果表明:OPO12₁₀₀₀的大小为946个碱基,不含有与已报道的稻瘟病菌Mg-SINE、Fosburry、Magyy、Grasshopper、Pot2以及Pot3等同源的重复序列。根据OPO12₁₀₀₀的核苷酸序列,设计了1对24个核苷酸的特异引物,对无毒表型亲本S1522和毒性表型亲本S159、无毒表型群体基因池、毒性表型基因池以及有性杂交后代108个菌株进行了PCR扩增,所有无毒表型的菌株均能特异性地扩增出1条与OPO12₁₀₀₀大小相同的DNA条带,而毒性表型的菌株除5个重组个体外,均不能扩增出这条特异带。此结果表明,与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik^m连锁的RAPD标记OPO12₁₀₀₀被成功地转化为SCAR标记,为进一步通过染色体步移克隆该无毒基因奠定了基础。     

稻瘟菌GP66激发子诱导的水稻膜脂过氧化及其保护酶活性变化

 以抗稻瘟病水稻近等基因系C101LAC及背景品系CO39为材料,研究稻瘟菌(Magnaporthe grisea)来源的GP66激发子诱导的水稻膜脂过氧化及保护酶活性变化.结果表明,激发子诱导非亲和性互作水稻超氧阴离子(O₂^·)积累和脂氧合酶(LOX)活性在早期明显高于亲和性互作水稻;O₂^·积累和LOX活性的升高进而导致了非亲和性互作水稻的膜脂过氧化,其相对电导率及丙二醛(MDA)含量出现的高峰期和强度也明显要早和高于亲和性互作水稻.超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均趋于下降,不同亲和性互作水稻间的变化则不明显;非亲和性互作水稻过氧化物酶(POD)活性则在激发子诱导早期明显高于亲和性互作水稻,可能与其参与其它抗性有关.这些结果表明膜脂过氧化的发生是激发子诱导水稻抗性的主要生理机制之一.     

水稻主要抗瘟基因对福建稻瘟菌群体的抗性分析

 用1995-2003年间在福建省水稻产区采集的稻瘟菌代表菌系的108个分离菌,它们在CO39近等基因系上测定被划分为30个毒性类型,用它们在30个水稻抗稻瘟病近等基因系或单基因系品种上进行抗病性测定。结果表明水稻抗稻瘟病基因Pi-k^h抗性最强,抗性频率高达98.15%,Pi-1和Pi-9(t)也具有较高的抗性频率,是较好的抗源;对2个和3个Pi基因的联合抗性频率的分析,发现一些联合抗性频率极高,甚至有达到100%的组合,表明抗瘟育种采用多个Pi基因聚合,易于获得抗性强的品种。根据抗病基因与供试菌株互作的亲和性,对供试30个Pi基因可能的系统关系分析得到的初步信息可为抗病基因的聚合与布局策略提供参考。     

超氧自由基在三环唑防治稻瘟病中的作用

 研究了三环唑对水稻超氧自由基(O₂^{· -})产生的影响及其在病害防治中的意义,结果表明三环唑能刺激药剂-植物-病菌互作过程中O₂^{· -}的产生。O₂^{· -}清除剂甘露醇和抗坏血酸对稻瘟病菌菌丝生长有一定的抑制作用,于接种后处理却对三环唑表现拮抗作用。外源H₂O₂和O₂^{· -}及从经三环唑预处理并接种的植株获得的叶片泌出液都对稻瘟病菌孢子萌发有直接的抑制作用,且三环唑对这种抑制作用表现明显的增效。说明刺激寄主产生O₂^{· -}和降低病菌的抗氧化能力可能是三环唑防治稻瘟病的作用机制之一