重组鸡痘病毒表达的鸡IL-1β和IL-2以及cMGF对新城疫LaSota疫苗免疫效果的影响

将128只10日龄SPF鸡随机分成8组，每只免疫1PD50的新城疫LaSota疫苗；同时Ⅰ～Ⅵ组鸡分别皮下注射不同剂量的重组鸡痘病毒rFPV-IL-1β、rFPV-IL-2或cMGF，而Ⅶ组和Ⅷ组鸡分别皮下注射鸡痘病毒wt-FPV和PBS作为阴性对照和空白对照。结果，重组鸡痘病毒表达的IL-1β、IL-2或cMGF可以消除鸡痘病毒在免疫后第7d对雏鸡体重增长的影响；一定剂量的IL-1β和IL-2可使鸡脾中CD4^＋T细胞在免疫后第7d和CD8^＋T细胞在免疫后第14d的总体水平提高；免疫第21d新城疫F48E8强毒攻毒后，一定剂量的IL-1β和IL-2能提高免疫保护率，而cMGF却无此作用。结果表明，重组鸡痘病毒表达的IL-1β和IL-2在一定剂量下可增强新城疫LaSota疫苗的免疫效果。     

鸡IL-6真核表达载体的构建及其对新城疫LaSota疫苗的免疫增强作用研究

利用RT—PCR方法从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞RNA中扩增出IL-6基因,与pCI—neo连接构建真核表达质粒pCI—IL-6,并研究pCI—IL-6在CEF细胞中的表达及其对新城疫LaSota疫苗的免疫增强作用。研究发现,pCI—IL-6在CEF细胞中得到表达,pCI—IL-6和LaSota疫苗联合免疫组HI抗体、CD4^＋、CD8^＋和CD3^＋T淋巴细胞百分含量从免疫后第14天起均高于LaSota疫苗单独免疫组。其中,HI抗体效价在第14、21和35天时差异显著（P〈0．05）,在第28天时差异极显著（P〈0．01）;CD4^＋、CD8^＋和CD3^＋T淋巴细胞百分含量在第14天后表现为差异显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01）。在免疫后第35天进行攻毒,pCI—IL-6和LaSota疫苗联合免疫组的保护率为89．5％,而LaSota疫苗单独免疫组的保护率为76．5％。结果表明,pCI—IL-6真核表达质粒在鸡体内成功表达,并能明显提高新城疫LaSota疫苗的免疫效果,具有免疫增强作用。     

鸡白细胞介素2对La Sota弱毒苗免疫效果促进作用的初步研究

为研究鸡白细胞介素2对新城疫La Sota弱毒苗免疫效果的促进作用,纯化真核重组质粒pcDNAChIL-2,细胞转染验证后,将重组质粒分为0,5,10,20和30μg 5个剂量组,分别与LaSota弱毒苗同时免疫7日龄雏鸡,免疫后7d,每隔1周分离鸡血清,测量血清中NDV的HI效价.结果表明,混合注射有pcDNAChIL-2重组质粒雏鸡的NDV抗体产生的水平显著升高,其中以20和30μg剂量组最为明显,提示ChIL-2可有效促进La Sota弱毒苗的免疫效果.     

鸡IL-1β、IL-2、IFN-γ和MGF对表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒免疫效力的影响

将10日龄的SPF鸡和15、28日龄的商品鸡分别随机分组,同时免疫不同剂量的rFPV-HN（表达NDV HN基因重组鸡痘病毒）和表达不同细胞因子（IL-1β、IL-2、IFN-γ、MGF）的重组鸡痘病毒（rFPVs）。在免疫后不同时间,通过检测血液中抗NDV的HN蛋白抗体、脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞的变化及攻毒保护率等指标。结果表明：IL-1β或IFN-γ在免疫后期能促进抗HN间接ELISA抗体的滴度上升,而且产生抗体的整齐度好;IL-1β或IL-2可以显著增加脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞含量;IL-1β、IL-2或IFN-γ同样可以提高商品鸡攻毒后的存活率。IL-2和IFN-γ在增加脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞的数量及攻毒保护方面表现出一定的协同增强作用。     

鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与ChIL-2重组禽痘病毒的构建及其免疫效力试验

将鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）gD基因和鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因通过同源重组法重组禽痘病毒转移载体,构建含ILTVgD基因和ChIL-2基因的重组禽痘病毒转移载体rFPVIL2ILTV—gD,蓝色蚀斑纯化法纯化重组病毒,用IFA检测重组病毒中ILTVgD基因的表达和用ELISA试剂盒检测ChIL-2的表达。重组病毒rFPV—IL2-ILTV-gD免疫试验鸡,间接ELISA测定血清中ILTV抗体效价,动物试验用构建的ILTV强毒以滴鼻方式攻击各组试验鸡,结果表明,外源基因在重组禽疽病毒中得到了稳定表达;ELISA检测结果表明在免疫7d后能够检测到血清抗体,免疫21d后血清抗体达到高峰,此后便开始逐渐下降,符合疫苗免疫的消长规律;攻毒后每组鸡的发病情况可以看出重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组和疫苗对照组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96％和92％,而空白对照组为8％。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV—gD免疫效力稍优于弱毒疫苗,能够较好的保护免疫鸡群。     

鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗对新城疫La Sota疫苗免疫效果的影响

用鸡传染性法氏囊病(IBD)免疫复合物疫苗免疫1日龄SPF雏鸡和普通京粉雏鸡,间隔1、2周后免疫新城疫La Sota疫苗,以单独免疫新城疫La Sota疫苗为对照,免疫后2、3、4和5周对各组鸡采血测定新城疫HI效价,并在免疫5周后用新城疫强毒攻击,计算各组保护率。结果显示,1日龄时首免IBD免疫复合物疫苗间隔不同时间再免疫新城疫La Sota疫苗,与单独免疫新城疫La Sota疫苗相比,新城疫HI抗体水平均无显著差异(P0.05)。证明IBD免疫复合物疫苗在SPF雏鸡和普通雏鸡上对新城疫La Sota疫苗免疫均无免疫抑制作用。     

鸡IFN-γ重组鸡痘病毒对鸡传染性腔上囊炎MB43弱毒疫苗免疫鸡免疫应答的影响

将重组鸡痘病毒（rFPV—IFN-γ）与IBDMB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡，研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响。结果显示，rFPV—IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rFPV-IFN-）＂）及rlFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rIFN-γ）在免疫后第2周即可检出ELISA抗体，比MB43疫苗单独免疫组早1周。用IBDVGx株攻击后，MB43＋rFPV-IFN-γ组和MB43＋rIFN-γ组免疫鸡的脾只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解，少数滤泡萎缩变性坏死；胸腺损伤程度轻于MB43疫苗单独免疫组和非免疫对照组。免疫后1周，3个免疫组外周血CD8^＋T淋巴细胞含量均显著高于非免疫对照组，CD4^＋T淋巴细胞含量变化不明显；攻毒后第2周，3个疫苗免疫组CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量均显著升高，各组之间CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量无明显差异。证实，rFPV—IFN-γ和rIFN-γ可加强疫苗的细胞免疫和体液免疫应答。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组病毒免疫及强毒攻击后外周血T淋巴细胞亚群的动态

采用流式细胞检测技术对表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV-gB-F）、新城瘦弱毒疫苗以及传染性喉气管炎弱毒疫苗免疫和传染性喉气管炎以及新城疫强毒攻击后外周血T细胞表型亚类（CD4^＋、CD8^＋、XCRγδ^＋）的变化动态进行监测。重组疫苗和禽痘疫苗免疫之后，CD8^＋和TCRγδ^＋的细胞数先升高后回落；在NDV强毒攻击之后，ND疫苗免疫组的TCRγδ^＋数量升高，rFPV-gB-F免疫组的三种细胞数量在第l周都下降，随后升高；ILT疫苗在免疫后的第1周，CD4^＋细胞数量下降。结果提示rFPV-gB-F可以诱发相应的细胞免疫应答，但是有关传染性喉气管炎病毒导致的细胞免疫需要进一步的研究，     

鸡IL-2和IL-15基因真核表达质粒对禽流感疫苗的免疫增强作用

根据GenBank中的鸡IL-2和IL-15序列设计了2对引物，采用RT-PCR法从山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆了IL-2和IL-15基因，与pcDNA3．1连接构建了真核表达质粒pDNAIL-2和pDNAIL-15，研究了其对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示，免疫后第10d，pDNAIL-15＋AI灭活疫苗组和pDNAIL-2＋AI灭活疫苗组HI抗体水平显著高于AI灭活疫苗组（P〈0．05）。免疫后第10d，pDNAIL-15＋AI灭活疫苗组CD4^＋淋巴细胞百分含量显著高于pDNAIL-2＋AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组（P〈0．05）；免疫后第23d，pDNAIL-2＋AI灭活疫苗组CD4^＋淋巴细胞百分率显著高于pDNAIL-15＋AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组（P〈0．05）。证实pDNAIL-2和pDNAIL-15能提高禽流感灭活疫苗的免疫效果。     

单表达和共表达NDVF和HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的免疫效力比较试验

为评价母源抗体对抗新城疫病毒(NDV)重组鸡痘病毒(rFPV)活疫苗免疫效力的影响,本研究用单表达、共表达NDV基因VII型病毒ZJ1株F、HN基因的rFPV活疫苗rFPV-12LSF、rFPV-12LSHN、rFPV-12LSFHN和油乳剂灭活疫苗分别免疫14日龄商品蛋鸡,rFPV疫苗的免疫剂量均为2×104pfu,免疫后21d分别用106ELD50NDV不同强毒株攻毒。其中F48E8株攻毒的免疫保护率分别为30.3%、73.2%、41.1%;而ZJ1株攻毒的免疫保护率分别为89.3%和35.8%、67.9%、78.6%、100%。用表达鸡IL-2基因的rFPV-12LSIL-2与rFPV-12LSHN联合免疫没有提高rFPV-12LSHN疫苗的免疫保护力。试验结果表明,单表达NDV HN基因的rFPV-12LSHN可作为NDV活疫苗候选株,为NDV重组鸡痘病毒活疫苗的进一步应用性开发奠定了基础。     

表达MDV—gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

将马立克氏病病毒（MDV）gB基因插入鸡痘病毒中，构建了含有MDV－gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV)，用rFPV、火鸡疱疹病毒（HVT）冻干疫苗、rFPV HVT二联疫苗分别免疫1日龄AA肉用雏鸡，8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，3种疫苗均诱导了免疫应答，免疫保护率分别为69％、69％和85％。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当，二者联用具有免疫协同作用。     

重组白细胞介素2对固始鸡空肠黏膜免疫增强作用的研究

本试验旨在研究重组白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）对固始鸡空肠黏膜免疫的作用。 以父母代固始鸡为试验动物,用添加不同剂量的重组IL-2佐剂的鸡新城疫疫苗对试验鸡进行分组免疫,应用免疫组织化学技术,通过Qwin图像处理系统对鸡空肠内分泌型免疫球蛋白A（sIgA）阳性细胞及其分泌物分布和阳性面积量进行系统分析。结果表明,sIgA阳性细胞及其分泌物主要分布于肠绒毛的固有层和肠腺腔中。在新城疫疫苗组中添加重组IL-2能够提高sIgA细胞的分泌,从而提高动物体的免疫能力。重组IL-2对增强免疫性有一定的作用,且IL-2的添加剂量在50 μg时对增加新城疫疫苗的免疫性效果最佳。      

表达马立克氏病病毒CVI988／Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB）基因构建成重组鸡痘病毒（rFPV）。以MDV　GA或Md5和RBIB混合攻毒，在不同品种的鸡中评价rFPV－gB／R单价苗和与火鸡疱疹病毒（HVT）组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明，MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中，rFDV－gB／R均能提供免疫保护作用，且其中一种商品蛋鸡中rFPV－gB／R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用，均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出，rFPV－gB／R与常规疫苗一样，可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡Ⅱ型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

将鸡Ⅱ型干扰素（ChIFNγ）基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插人到鸡痘病毒转移载体中，构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY—ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），经过8轮蓝斑筛选，得到纯化的能够同时表达鸡Ⅱ型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV—ChIFNγS1。rFPV—ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后，可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体，重组病毒接种鸡的CD4^＋、CD8^＋和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡（P％0．05）；免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击，rFPV—ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状（1／16），而非免疫对照组则有16只发病（16／16），并有2只出现死亡（2／16），表明rFPV—ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。     

半胱胺对鸡十二指肠和脾脏中自细胞介素-2含量的影响

在口服2种剂量生长抑素耗竭剂半胱胺(CS-Ⅰ组、CS-Ⅱ组口服剂量分别为20、80mg／kg)的基础上，应用新城疫弱毒疫苗对鸡进行消化道粘膜免疫，采用放射性免疫分析法测定了鸡十二指肠和脾脏中白细胞介素-2(IL-2)的含量。结果表明，应用半胱胺首免后3周，CS-Ⅰ组十二指肠和脾脏中IL-2的含量比仅用新域疫弱毒疫苗免疫组显著增加(P＜0．05)；CS-Ⅰ组十二指肠中lL-2含量比仅用新城疫弱毒疫苗免疫组极显著增加(P＜0．01)；首免后4周，CS-Ⅰ组脾脏中IL-2含量比仅用新城疫弱毒疫苗免疫组显著增加(P＜0．05)；在十二指肠CS-Ⅰ组和CS-Ⅱ组IL-2含量比仅用新城疫弱毒疫苗免疫组均显著增加(P＜0．05)。由此可推测，生长抑素可抑制十二指肠和脾中IL-2的释放。应用生长抑素耗竭剂半胱胺可以促进十二指肠粘膜和脾脏中IL-2的释放，增强机体的粘膜免疫功能。     

鸡传染性支气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LTJ95Ⅰ株病毒攻击的免疫保护

将共表达鸡传染性支气管炎病毒（mv）S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒（rFPV—IFN-γ S1）接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用同源（LX4株）及异源强毒株（LTJ95I）攻毒,评价重组疫苗对异源病毒的保护作用。结果显示,重组疫苗接种1周后,免疫鸡产生抗IBV的抗体;而且外周血中CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞的含量略高于非免疫对照组;攻毒后,异源强毒株攻毒的免疫组CD4^＋T淋巴细胞呈下降趋势,并且该组低水平CD4^＋的状态一直持续到试验结束,而其他组CD4^＋T淋巴细胞均迅速上升,峰值达到14．5％;同源强毒株攻毒的免疫组CD8^＋T淋巴细胞呈高水平的表达,而其他组攻毒后均无明显变化;保护率结果显示,同源强毒株攻毒免疫组的发病率和死亡率为21．43％和0％,与其他各组相比均有显著差异;另外同源强毒株攻毒的免疫组病理损伤与异源强毒株攻毒的试验组相比明显减轻,其排毒时间和排毒量也均有所减少;强毒攻毒后所有试验组体重无显著差异。以上结果可以说明,重组疫苗能对同源强毒株产生较好的免疫保护,但不能对遗传关系较远的强毒株产生有效的免疫应答。     

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。     

脂质体包被鸡IL-18可增强新城疫活疫苗的免疫效果

首次将重组鸡白细胞介素18(mChIL-18)用脂质体包被,将不同浓度的mChIL-18脂质体联合新城疫疫苗对鸡群进行免疫,观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。1日龄SPF鸡分为6组,分别为空白对照组、单纯疫苗组、新城疫疫苗+0.2mL mChIL-18组、新城疫疫苗+0.1mL mChIL-18组、新城疫疫苗+0.3mL mChIL-18组和新城疫疫苗+空载体对照组。所有免疫组鸡于7日龄免疫,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用血凝抑制试验和流式细胞仪来检测免疫鸡的HI抗体水平及CD4+和CD8+T淋巴细胞的变化情况。并于最后一次采血后,对各组试验鸡应用F48E9标准强毒进行攻击(100ELD50.只-1)。结果表明mChIL-18脂质体的最佳剂量为0.2mL.只-1,其不仅能够显著增强机体的细胞免疫和体液免疫,而且还可以明显提高新城疫疫苗的保护率。     

鸡白细胞介素-2（IL-2）基因与真核表达质粒及禽类疫苗的免疫增强剂

内容介绍：本发明提供了一种鸡白细胞介素-2（IL-2）基因。本发明还提供一种含有IL-2基因的真核表达质粒，它以pC工作为真核表达载体，含有上述白IL-2基因的编码序列的重组载体。本发明还提供了一种禽类疫苗的免疫增强剂。它为上述真核表达质粒的水溶液。其浓度为1～20μg／μl；或为含有上述真核表达质粒在真核细胞或动物体内所表达的鸡白细胞介素-2蛋白。鸡白细胞介素-2蛋白所占重量比为1％～20％。     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.