花生矮化病毒3种PCR检测方法的建立和比较

建立了花生矮化病毒（PSV）普通RT-PCR、SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR检测方法,并比较了它们的检测灵敏度。结果表明,以阳性对照为样品,普通RT-PCR灵敏度达到10-4,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度相当,相对灵敏度均可达到10-6;检测混有PSV的大豆叶片样品,普通RT-PCR灵敏度为10-1,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度为10-5;SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR方法比直接RT-PCR灵敏度高至少100倍,尤其在带毒植物叶片检测中优势更明显,而且灵敏、简便、同时重复性好。     

掺水牛乳快速检测方法的建立及应用

根据一般水（地下水、地表水）中含有一定量的硝酸盐（ＮＯ－３）和亚硝酸盐（ＮＯ－２）,而牛乳中不含这两种物质的原理,用锌粉将ＮＯ－３还原为ＮＯ－２,用格里斯（Ｇｒｉｅｓｓ）试剂与ＮＯ－２的呈色反应,便可检测出牛乳中是否掺水并估计掺水量。可为鲜乳收购时鉴定掺水情况提供一种实用的检测方法。     

猪细小病毒LAMP检测方法的建立

 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。     

抗草甘膦小飞蓬检测方法的建立

采用温室生物测定法建立小飞蓬对草甘膦的抗性检测方法。小飞蓬幼苗长至5~7叶期,单株移栽,15~20叶时,按不同浓度处理喷施草甘膦。用药后3 d进行第一次观察,记录各浓度的药害症状,并划分药害级别。以后每隔4 d记录1次,药害级别转化为药害综合指数。当不同处理间的药害症状有极显著差异时进行鲜重和干重的测定。分别以所获得的药害综合指数、鲜重、干重和药剂剂量的对数进行回归,所有的数据都用log-logistic回归模型进行模拟。通过比较两次重复实验的结果,证实采用药害分级、鲜重、干重的方法都能较好地反映小飞蓬受害情况和不同剂量草甘膦处理间的关系,但药害分级的方法是3种方法中重复性最好的一种。     

4种重要外来病毒高通量液相芯片检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)、西尼罗病毒(WNV)、裂谷热病毒(RVFV)和南非型口蹄疫病毒(SAT FMDV)的高通量液相芯片检测方法,根据GenBank上公布的PPRV的N蛋白基因序列、WNV的E蛋白基因序列、RVFV的S片段基因序列和FMDV的5′UTR区基因序列,并基于各基因保守区设计相应的引物和探针.通过对多重PCR的上游、下游引物比例、杂交温度、杂交时间进行条件优化,并验证检测方法的特异性和敏感性.敏感性试验显示,该方法对于PPRV、WNV、RVFV以及FMDV 4种病毒最低检出量分别为5.78×103、2.15×103、2.98×105、9.54×104 copies/μL.本研究建立的高通量液相芯片检测方法能够同时快速地检测4种外来病病毒,具有良好的特异性、敏感性和稳定性,对于流行病学调查和防范外来动物疫病具有重要的意义.     

牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法，为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列，利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测BRV的RT-PCR方法，同时开展了特异性、敏感性和重复性试验，并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段，对其他畜禽常见病原体无特异性扩增；该方法的灵敏度为6.86×10⁵ copies·μL^-1。对22份临床样品进行检测，检测出12份阳性样品，阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可应用于临床样本的检测，为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。     

BVDV荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)毒株序列,选择5'NTR保守区域设计1对特异性引物和1条Tagnum探针,通过矩阵法筛选引物探针的最佳浓度,建立了检测BVDV的荧光RT-PCR方法.结果显示,用1.5μL上下游引物混合液(10 μmol/L)和0.5 μL探针溶液(10 μmol/L)对BVDV进行检测,可获得较小Ct值、较高吸光值,并可降低检测成本.对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好.将该方法应用在疫苗生产中,可快速准确地筛选出合格的原辅材料和半成品,为生产提供及时准确可靠的数据.     

测定橡胶树种子活力的6种方法比较

采用比较研究法，比较了6种方法测定橡胶树种子活力的准确度。结果表明：对于新鲜或比较新鲜的种子，几种简易测定方法的准确度比较高（其中对“好种子”的误选指数较低，对“坏种子”的误选指数则较高）；准确度也会因品种和批次不同而有所差异。“种仁鉴别法”和TTC法可作为较高准确度的检测方法，“外观法”、“弹跳法”等则宜作较低准确度的检测方法。     

红掌花叶病病原鉴定及检测方法的建立

以红掌为材料,利用RT-PCR方法鉴定出红掌花叶病的一种病原--芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DMV）,并建立了该病毒的RT-PCR检测方法.依据该方法,将从0.1 g染病组织中提取的总RNA稀释500倍,仍能从中检测出DMV的存在,说明该方法的灵敏度高.该检测方法的建立,为红掌栽培,尤其是工厂化生产红掌无毒种苗提供了技术支持.     

掺水牛乳快速检测方法的建立及应用

根据一般水（地下水，地表水）中含有一定量的硝酸盐和亚硝酸盐，而牛乳中不含这两种物质的原理，用锌粉将ＮＯ＾－３还原为ＮＯ＾－２，用格里斯试剂与ＮＯ＾－２的呈色反应，便可检测出牛乳中是否掺水并估计掺水量，可为鲜乳收购时鉴定掺水情况提供一种实用的检测方法。     

实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立

[目的]建立Taqman探针荧光定量RT-PCR检测传染性胰脏坏死病病毒（IPNV）的方法。[方法]选取IPNV病毒的基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物与探针。以梯度稀释的含有IPNV目的扩增片段的质粒作为标准品,探索定量RT-PCR反应条件。[结果]当标准品浓度在102～106 copies/μl之间时,标准品浓度（X）与Ct的关系为Ct=-3.426 lgX＋4.481,相关系数R2为0.999 8。该法对病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）、鲤春病毒血症病毒（SVC）和流行性造血器官坏死病病毒（EHNV）,草鱼呼肠孤病毒（GCRV）,大鳞大麻哈鱼胚胎细胞（CHSE-214）和虹鳟的核酸都没有扩增反应。[结论]该检测方法灵敏度高,特异性好,可用于鱼类传染性胰脏坏死病病毒的快速定量检测。     

猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体P36(L-乳酸脱氢酶)全基因序列,设计合成了2对引物,建立套式PCR方法。运用该方法对猪肺炎支原体不同菌株培养物进行了扩增,并对经肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后支气管肺泡灌洗液进行了检测。结果表明,不同菌种均能扩增出427 bp的目的条带,而其他病原菌未出现特异性扩增条带。建立的套式PCR方法检测猪肺炎支原体的最低检测限度为10个CCU(颜色变化单位)。支气管肺泡灌洗液检测结果表明,经肺内免疫的猪支气管肺泡灌洗液扩增结果均为阳性。     

PCV2套式PCR检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,设计1对PCV2型特异性引物,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18-T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中,提取质粒进行套式PCR、酶切、测序鉴定,结果扩增出了PCV2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上。用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,阳性率为63%。     

锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

为建立快速有效的锦鲤疱疹病毒病检疫方法,根据锦鲤疱疹病毒(KHV)聚合酶基因(Sph)的保守序列设计1对引物和相应的TaqMan探针,建立了一种快速检测锦鲤疱疹病毒病荧光PCR方法。用建立的检测方法对细胞培养物进行检测,并与常规PCR对比,结果荧光PCR灵敏度高于普通PCR,能检出的最低拷贝数为1.6×102/μL。应用该方法对样品进行检测,结果表明:所建立的荧光PCR检测方法4 h内可报告检测结果。该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等特点,适用于锦鲤疱疹病毒的快速检疫。     

鹿慢性消耗性疾病免疫组织化学检测方法的建立与优化

【目的】在自主研制的抗鹿朊蛋白单克隆抗体基础上,建立和优化了鹿慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）诊断方法。【方法】按照常规石蜡病理切片制作方法制备阴性和阳性切片,应用ABC法对获得的5株单抗进行免疫组织化学检测。【结果】试验结果表明,5株单抗（编号分别为5A5、3B2、6D12、5E3、1F5）中只有5E3和3B2可以与CWD的阳性鹿延髓切片发生特异性免疫反应,而且5E3的反应较强烈,3B2的反应较弱,其它3株单抗则在试验的浓度范围内无特异性免疫反应。此外,5E3的稀释比例为1：10 000时,免疫反应效果达到最佳状态。【结论】实验结果表明,单抗5E3可以用于我国CWD的监测。     

猪鼻支原体套式PCR诊断方法的建立及应用

为建立猪鼻支原体快速诊断方法,根据猪鼻支原体P69基因序列设计2对引物,建立了猪鼻支原体套式PCR诊断方法,对建立的方法进行特异性、敏感性检测,同时进行临床检测。结果表明,应用建立的套式PCR方法对猪鼻支原体DNA的检出限为1.4×10~(-5)ng/μL,与常见感染猪的细菌、病毒均无交叉反应。利用建立的套式PCR方法对23份临床样品进行检测,阳性检出率为73.9%。本研究建立的猪鼻支原体套式PCR具有特异性强、敏感性高等优点,可用于猪鼻支原体的临床诊断。     

小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立

【目的】通过表达羊PrPc核心片段、单抗制备，最后建立免疫组织化学检测羊痒病方法。【方法】用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增编码PrPc核心片段DNA， 并克隆到硫氧还原蛋白融合表达载体pET-32a（+）上，转化至E.coli BL21，IPTG诱导融合表达。以纯化的重组小尾寒羊PrPc核心片段免疫PrPc基因敲除小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备羊核心片段单克隆抗体。【结果】通过上述方法，得到相对分子质量约为35 kD的重组小尾寒羊PrPc核心片段，筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrPc核心片段特异单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化试验表明,其中4株可特异性识别羊痒病脑组织切片中耐PK酶消化的PrPsc，经5次重复试验表明：所制备单抗与对照单抗F89结果完全一致。【结论】利用原核表达，单抗制备等技术制备出PrP特异性单克隆抗体，用笔者自己研制的单抗作为核心试剂初步建立了羊痒病免疫组化检测方法。     

呋喃西林代谢物酶联免疫检测方法的建立

[目的]建立动物性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测方法。[方法]通过制备特异性强的单克隆抗体,采用间接竞争ELISA法建立动物性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测方法,并研制出对动物性食品中呋喃西林代谢物残留检测的试剂盒。[结果]该试剂盒标准曲线的IC50值为0.267 7μg/L,最低检测限为0.1μg/kg,样本加标回收率范围为79.5%～95.6%,变异系数为7.6%～9.7%。在交叉反应试验中,对呋喃西林的交叉反应率为25%,与其他药物的交叉反应率均小于1%,表明该方法具有很强的特异性。[结论]该方法灵敏度、准确度、精密度均较高,能满足兽药残留的检测要求,且检测时间短(45 min),样本前处理简单、检测成本低,适合于大量样本中呋喃西林代谢物残留检测的快速筛选。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR诊断犬瘟热病毒方法的建立

根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示:实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。     

枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用

参照Gen Bank中登录的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因,设计1对引物,扩增片段大小为460 bp的基因片段,该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立枯草芽孢杆菌PCR检测方法,且该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点。