羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊口疮病毒(ORFV)H2L基因序列,设计合成1对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊口疮病毒DNA的PCR检测方法.结果显示,用这1对引物均能扩增出羊口疮病毒507 bp的特异性片段,同时检测口蹄疫病毒和山羊痘病毒,结果均为阴性,最小检出量为5 pg.该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床组织病料中的ORFV进行快速检测.     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒（ENTV-2）SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R~2=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10~2 copies·μL~(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。     

牛结核杆菌病PCR检测方法的建立及初步应用

根据PCR技术原理.建立了牛结核病PCR诊断方法,并测定出该方法的敏感性为1.025 Pg,茵细胞的灵敏度为200个茵左右.特异性试验表明,除牛结核分枝杆菌的特异扩增带(317 bp)外,其他的细茵均未出现特异性扩增带.采用PCR检测方法,通过对94份奶牛奶样的检测.得到牛结核分枝杆茵的阳性率为11.7%(11/94),PCR和胶体金方法检出率有明显的差异.PCR方法敏感性强,特异性高,是一种提高牛结核病临床诊断的好方法.     

羊口疮LAMP诊断方法的建立及其初步应用

根据GenBank中的羊口疮B2L基因序列,设计合成2对引物,通过对环介导等温扩增条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了羊口疮LAMP诊断方法.敏感性结果显示,建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为0.50pg/L,而PCR诊断方法最低核酸检测量为50pg/L,特异性结果显示,羊大肠杆菌、羊沙门氏菌、口蹄疫病毒、山羊痘病毒的扩增结果均为阴性.对195份自然感染病羊样品的检测结果表明,该LAMP方法检测结果与PCR检测结果符合率为96.4％.整个扩增反应可在30min内完成,结果肉眼可见,为羊口疮的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法,从而满足基层现场快速检疫需要.     

羊吕氏泰勒虫PCR检测方法的建立与应用

为建立一种准确、敏感的羊吕氏泰勒虫检测方法,根据Gen Bank上发表的羊吕氏泰勒虫18S rRNA基因序列(登录号:KC735166.1),设计1对特异性引物,建立了PCR检测方法。筛选该方法的最佳反应条件及体系,并进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床血液样品检测。结果表明,该方法能扩增出大小为962 bp的羊吕氏泰勒虫特异性片段,与GenBank收录的相关参考序列同源性高达99.4%~99.9%;与绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为29.13 fg·μL~(-1);具有良好的重复性;对76份羊临床血液样品检测结果表明,羊吕氏泰勒虫感染率为77.63%,高于已报道的常规PCR检测结果。     

羊附红细胞体巢式PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种更加准确、敏感的羊附红细胞体检测方法,根据Gen Bank上发表的羊附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号:AF338268),设计内、外2对特异性引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性、重复性试验及临床样本检测。结果表明,该方法能扩增出大小为506 bp的羊附红细胞体特异性片段,与Gen Bank收录的相关参考序列同源性为97.8%~99.6%;与猪附红细胞体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊无浆体、莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为0.654 fg·μL~(-1);具有良好的重复性;对77份羊临床血液样品检测结果表明,羊附红细胞体感染率为71.43%,高于常规PCR和已报道的巢式PCR检测结果。     

捻转血矛线虫PCR检测方法的建立及其应用

为了能从粪便中对捻转血矛线虫卵进行特异性检测,基于捻转血矛线虫ITS2-28S基因序列设计特异性引物,通过对退火温度反应条件优化,建立捻转血矛线虫特异性PCR检测方法。结果显示,该方法成功从捻转血矛线虫卵中扩增出约270 bp的特异性片段,其最低检出质量浓度为0.298 pg/μL,敏感性较高;进一步对捻转血矛线虫、细颈线虫、粗纹食道口线虫等多种线虫的虫卵DNA样品进行扩增,该方法仅能特异性扩增出捻转血矛线虫卵的目的片段,证明特异性良好。利用所建立的PCR检测方法对120只山羊的粪便样品进行检测,显示受检样品中捻转血矛线虫阳性率为38.3%,高于显微镜检测结果(阳性率为24.2%)。结果表明,该研究建立的PCR方法能够应用于临床检测山羊粪便样品中的捻转血矛线虫卵,可为山羊捻转血矛线虫病的诊断与防治提供有效技术支持。     

基于绵羊无浆体Groel基因的PCR方法的建立

利用绵羊无浆体(Anaplasma ovis)高度保守的Groel基因,建立了快速、特异、敏感的绵羊无浆体检测方法。根据Gen Bank上登录的绵羊无浆体Groel基因序列(FJ460438),设计1对特异性引物,建立了绵羊无浆体PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果显示,该方法能特异性地检测绵羊无浆体,与山羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、边缘无浆体、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、羊附红细胞体、弓形虫基因组均无交叉反应;该方法检测下限可达到7.7×10-15g·μL-1,比文献报道的PCR敏感10倍(77×10-15g·μL-1);具有良好的重复性;对81份羊临床血液样品检测结果表明,绵羊无浆体感染率为32.1%(26/81),高于文献报道的PCR(MSP4基因)检测结果(18.5%,15/81)。     

绵羊肺炎支原体和山羊伪结核棒状杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】为实现临床上对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Mo)和山羊伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)两种病原混合感染的同时检测,建立Mo和CP的双重PCR检测方法。【方法】应用基于Mo的P80基因和CP的PLD基因设计两对特异性引物,对反应体系和条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏性和重复性;应用该方法和单一PCR方法对临床收集的70份样品进行检测,比较检测结果。【结果】建立的Mo和CP的双重PCR检测方法能够同时扩增出Mo 700 bp和CP 290 bp左右的片段,而对其他羊病常见病原的DNA扩增均为阴性。Mo和CP的检测下限分别为1 530 pg·μL-1和3 500 pg·μL-1。该方法具有良好的重复性。临床样品检测结果显示:70份临床样品中Mo阳性率为25.71%,CP阳性率为18.57%,同时感染Mo和CP阳性率为7.14%,与单一PCR检测结果符合率为100%。【结论】本研究建立的双重PCR检测方法具有特异性强、灵敏性较高、重复性好等特点,为临床上Mo和CP混合感染的快速检测以及流行病学调查提供了实用方法。     

牛源环孢子虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

 【目的】 建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列，设计1对保守引物和1对特异性引物，建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件，进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段，与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应；最低能检测到2.85×10-2 fg的阳性参照DNA；对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性，有较好的临床应用价值。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

针对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)16 S rRNA序列设计1对特异性引物,能扩增出821 bp的特异性DNA片段,并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性.13份疑似病料检测结果表明,PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100％.结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌PCR检测方法,并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测.     

鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

猪弓形虫病PCR诊断方法的建立

以具有35个拷贝的重复序列B1基因作为弓形虫种特异的遗传标记,建立诊断弓形虫病特异性的PCR方法.敏感性和特异性试验结果表明:该PCR方法最低能检测到10个弓形虫速殖子DNA,且与寄生于猪体内的6种常见微生物无交叉反应,说明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性.动物感染试验检测结果表明,在试验动物出现明显临床症状时,对取材的7个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中扩增结果最清晰的的组织为肺和肝组织.     

重庆市羊附红细胞体感染情况研究

参考GenBank登录的羊附红细胞体16S rRNA序列设计引物,建立检测羊附红细胞体16S rRNA的特异性PCR方法,对重庆市14个区县山羊进行附红细胞体感染的分子流行病学调查.结果表明:重庆市附山羊红细胞体感染率为16.1%;其中1周岁以下羊附红细胞体感染率为13.9%,低于1周岁以上羊附红细胞体感染率(17.0%).重庆黑山羊、波尔山羊、南江黄羊和板角山羊的附红细胞体感染率分别为15.9%,16.3%,16.6%和17.6%.     

鹅源性成分PCR检测方法的建立

[目的]建立一种检测鹅源性成分的PCR方法。[方法]以15种动物的DNA为模板,利用鹅的特异性引物进行PCR反应,PCR产物用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序,检测引物的特异性和敏感性。[结果]通过PCR反应从鹅样品中扩增到了304bp的目的片段,其他物种火鸡、鸭、鸽鹑、鸵鸟、鸽子、鸡、马、牛、羊、猪、狗、驴、猫、鱼和空白对照则无目的片段,表明该引物的特异性良好。鹅组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列基本符合,相似性为98％;PCR检测方法的检测灵敏度为0．01％。[结论]该PCR检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高、可重复性好,为明确食品与饲料的成分和来源,预防禽流感的传播提供了有效的分子生物学捡测方法.     

猪日本乙型脑炎及猪细小病毒复合PCR检测方法的建立

根据GenBank上登录的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)与猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)参考基因序列,设计合成2对特异性引物,在建立优化单项PCR检测方法的基础上,建立了PPV-JEV复合PCR检测方法,可扩增出预期的238 bp和152 bp特异性片段。该方法敏感性高、稳定性好、特异性强,临床样品检测结果与单项PCR检测结果符合率100%,该方法适合JEV和PPV的联合检测和鉴别诊断。     

羊传染性脓疱病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的羊传染性脓疱病毒VIR基因序列(No.KF666563.1),利用Beacon Designer 7.9软件设计1对特异性引物,建立羊传染性脓疱病毒VIR基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测羊传染性脓疱病毒,对羊常见病原无特异性扩增;最低检测限为100copies·μL~(-1);组内和组间变异系数均小于2%;应用该方法对39份临床样品进行检测,阳性率为94.9%(37/39)。以上结果表明该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适合于羊传染性脓疱的病原学检测和流行病学调查。     

AIV、NDV和安卡拉病毒多重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立鉴别禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和安卡拉病毒(FAV-4)的多重PCR检测方法。【方法】根据GenBank已登录的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列,设计合成了3对特异性引物。提取3种病毒DNA/RNA,通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。应用建立的多重PCR方法对67份临床病料进行检测,并将其结果与已建立的单重PCR检测结果进行比较。【结果】成功建立了能快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,该方法特异性良好,对传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡痘病毒(FPV)、鸡马立克病病毒(MDV)的扩增结果均为阴性;敏感性较强,能检测出的NDV、FAV-4和AIV最低核酸质量浓度分别为24.3,30.4和28.0pg/μL。多重PCR方法临床病料的检测结果与单重PCR检测结果一致。【结论】建立的AIV、NDV和FAV-4多重PCR检测方法方法可以用于临床上3种病原的鉴别诊断。     

志贺菌ipaH基因PCR检测方法的建立及应用

为了掌握青海省4种食源性动物体内志贺菌的分布情况,针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid,ipaH)设计1对特异性引物,建立志贺菌的PCR检测方法,优化反应体系,检测该方法的敏感性和特异性,并将该方法应用于临床样本检测。结果表明,建立的PCR方法能特异性扩增志贺菌ipaH基因,而沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌等均未扩增出条带;最低检测限值为1.8 pg/μL。在临床样本检测中,100株疑似菌株的阳性率为62.00%,其中牦牛源75.00%(3/4),鸡源35.29%(12/34),羊源44.44%(8/18),猪源88.64%(39/44);新鲜鸡粪和羊粪的阳性率分别为91.67%(11/12)和90.91%(10/11)。这说明试验所建立的PCR方法具有良好的敏感性和特异性,可应用于志贺菌的实验室诊断;4种动物体内均不同程度带菌,在临床诊断和治疗时不可忽视该菌的致病作用。     

狐阴道加德纳氏菌PCR诊断方法的建立与应用

【目的】建立快速检测狐阴道加德纳氏菌的PCR诊断方法。【方法】根据阴道加德纳氏菌16S rRNA基因序列设计1对特异性引物,以分离的狐阴道加德纳氏菌菌体DNA为模板进行PCR扩增,建立狐阴道加德纳氏菌的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及其可行性进行检验。【结果】特异性试验结果表明,狐阴道加德纳氏菌能扩增出437 bp的特异性核酸片段,而大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为500 mL-1。利用建立的PCR检测方法,对9株从山东省不同地区分离的疑似狐阴道加德纳氏菌菌株进行检测,结果有4株为阳性。【结论】研究建立的狐阴道加德纳氏菌PCR快速诊断方法,敏感性高、特异性强,可1次检测多个样品。