棉花(Gossypium hirsutum)ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及鉴定

ROP是高等植物里一类分布广泛的信号小G蛋白,在植物生长、发育、抗逆、抗病和激素信号转导过程中起重要调控作用。本研究用PCR体外扩增技术获得棉花GhROP1基因片段,将目的基因与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组,构建诱饵质粒pGBKT7-GhROP1,并成功的转入到Y187酵母菌通过缺陷性培养基培养进行毒性和自激活检测。结果表明,成功克隆棉花GhROP1基因,该基因开放阅读框共有591 bp。双杂交诱饵表达载体pGBKT7-GhROP1构建成功,并成功转化酵母菌Y187;结果显示含表达载体的酵母菌Y187在SD/-Trp平板上长势良好,说明表达蛋白对酵母菌无毒害作用。在SD/-Leu,SD/-Trp-Leu,SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上则没有生长,说明转化pGBKT7-GhROP1质粒后的Y187酵母菌无自激活发生。本研究结果为下一步利用酵母杂交系统筛选GhROP1蛋白相互作用的蛋白提供理论参考。     

拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白,构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株,检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了AtCYS6基因,成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

马铃薯StERF5转录因子酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与马铃薯StERF5转录因子相互作用的宿主蛋白,构建其诱饵载体,本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StERF5基因的编码序列,克隆至载体p MD18-T,验证正确后插入到酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-StERF5及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGlod感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性。结果表明:扩增得到StERF5基因,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-StERF5,此诱饵载体对酵母宿主细胞无毒性且不具自主激活报告基因的功能。研究结果可为进一步利用酵母双杂交技术筛选与ERF5基因互作的宿主蛋白及功能研究提供科学依据。     

岩栖蝮蛇毒纤溶酶基因克隆、序列分析及真核表达载体的构建与鉴定

克隆岩栖蝮蛇（Gloydius saxatilis）纤维溶解酶（Fibrinolytic enzyme,FLE）基因,分析基因序列并对该基因的功能进行分析;构建真核表达载体并鉴定。从岩栖蝮蛇毒腺细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,再进行序列的测定并且对该序列进行分析。测序鉴定后将纤溶酶基因克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建该基因的真核表达载体pEGFP-FLE,进行双酶切、PCR和测序鉴定。扩增得到包括完整开放读码框在内的长为774 bp的纤溶酶基因序列,成功克隆了编码岩栖蝮蛇纤溶酶的基因序列,开放读码框编码257个氨基酸,其分子质量约为30 KDa,成功构建了真核表达载体pEGFP-FLE。成功克隆岩栖蝮蛇毒纤溶酶基因并构建该酶的真核表达载体为该基因的真核表达及后续研究提供依据。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

玉米淀粉分支酶SBEIIb基因片段酵母双杂交诱饵载体

为探寻玉米淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBEIIb)与其互作蛋白的作用位点,构建了酵母双杂交诱饵载体。根据CDD和NCBI对SBEIIb蛋白氨基酸序列的分析,确定玉米SBEIIb的功能域及非功能域,PCR扩增功能域及非功能域基因的目的片段,经回收纯化,用相同的限制性内切酶将其与载体pGBKT7进行双酶切后,分别将目的基因片段与载体pGBKT7进行连接。构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SBEIIb-X(X=1,2,3,4,5,6),转化酵母菌AH109的菌液,OD600值在0.8以上,证明诱饵载体pGBKT7-SBEIIb-X对酵母菌AH109没有毒性作用;转化诱饵载体后的酵母菌AH109,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,排除了pGBKT7-SBEIIb-X具有自激活宿主菌AH109的作用。构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7- SBEIIb-X(X=1,2,3,4,5,6),其表达对酵母细胞无毒性及对报告基因无自激活作用,可为下一步分析SBEIIb与其互作蛋白的作用位点奠定基础。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301, 并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）,经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

马铃薯StSOD1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与马铃薯超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因StSOD1作用的上游蛋白,构建其酵母双杂交诱饵重组载体。本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StSOD1的基因片段,通过与pMD-T18连接构建克隆载体,经验证构建成功后,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵重组载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过PEG/Li Ac法将诱饵载体pGBKT7-StSOD1与空载体pGBKT7分别转化到酵母AH109感受态细胞中,检测其是否有自激活作用和对酵母菌株的毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了StSOD1基因,成功构建了诱饵重组载体pGBKT7-St SOD1,并且此诱饵载体无自激活活性和对酵母菌株的毒性作用。此研究结果可进一步为筛选与StSOD1互作的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的表达研究

为了研究巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)在植物体内的定殖,利用酶切连接的方法,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因与表达载体p VLT-33为基本元件,构建了重组表达载体p VLT-EGFP,电转巴西固氮螺菌R7细胞,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)研究了不同温度、不同时间EGFP m RNA的表达情况。酶切及测序结果表明,成功构建了p VLT-EGFP载体,并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达;q PCR结果显示:30℃,诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体p VLT-EGFP,为实现p VLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。     

小麦Ta-SKP2A克隆及其酵母双杂交诱饵载体的构建

SKP2A是调控细胞周期转录因子降解的F-box蛋白。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程的作用,首先克隆获得中国春小麦Ta-SKP2A全长序列,然后将其与pGBKT7载体连接,转入酵母Y187感受态细胞中,构建酵母诱饵表达载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明,Ta-SKP2A编码区序列长度为1 146 bp,其ORF区编码一条由382个氨基酸组成的多肽。在ORF区两侧连接酶切位点(EcoRⅠ和Bam HⅠ),并将其与载体pGBKT7连接,成功构建了包含目的基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,其过夜培养物OD6000.8,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺营养缺陷平板上不能生长,表明诱饵质粒的表达产物不能自激活报告基因。成功构建了一个包含Ta-SKP2A的重组诱饵质粒,为深入筛选与其互作的靶蛋白,研究其在小麦-叶锈菌互作体系中的作用机制奠定了基础。     

芒果MiFTs基因家族克隆及其酵母双杂诱饵载体的构建

成花诱导是开花植物生长发育过程中最为重要的一环,而开花整合因子Flowering Locus T(FT)在这一过程中起非常重要的调控作用。目前,FT基因调控芒果成花的作用机制尚不清楚。本研究以‘四季蜜芒’为材料,克隆验证了从转录组测序数据中挖掘获得的3个FT同源基因,命名为MiFT1、MiFT2和MiFT3。生物信息学分析显示,3个MiFTs基因编码区长度分别为588 bp、540 bp和516 bp,分别编码氨基酸196个、180个和172个,分子量分别为48.97 kD、44.71 kD和42.27 kD,等电点分别为4.99、5.06和5.06,3个基因均含有一个保守的PEBP结构域。将MiFT1、MiFT2和MiFT3基因定向克隆到酵母表达载体pGBKT7上,通过菌落PCR和测序进行验证,并成功转化酵母菌株Y2H Gold感受态细胞。对诱饵质粒酵母菌进行自激活和毒性检测,发现pGBKT7-MiFT1、pGBKT7-MiFT2和pGBKT7-MiFT3在酵母菌种均不具备自激活性和毒性。此酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续蛋白互作筛选提供参考。     

甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。     

结球甘蓝雌蕊调控因子SPT与HEC1的克隆及相互作用分析

为研究SPT和HECs及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响, 以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料, 提取雌蕊总RNA, 根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物, 采用同源克隆的方法克隆SPT基因, 其序列1085 bp, 开放阅读框(ORF) 1062 bp; HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明, SPT编码353个氨基酸残基, 预测分子量为37.67 kD, pI为6.83; HEC1编码231个氨基酸残基, 预测分子量为25.26 kD, pI为10.2。分析表明, 两基因在各器官中均表达, 但SPT在果实和雌蕊中表达量最高, 而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用, 构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1, Pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体, 分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象, 融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑, 表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因, 酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致, 说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。     

利用酵母单杂交筛选拟南芥AtSTK基因表达调控蛋白的研究

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。     

灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。