猪瘟病毒E2基因疫苗表达抗原在小白鼠胫前肌的分布及消长

用免疫组化法检测了猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ｅ２囊膜糖蛋白基因免疫表达的抗原在小白鼠胫前肌中的分布及消长，结果：ＨＣＶ Ｅ２基因疫苗ｐＣＤＳＴ接种小白鼠胫前肌后，表达的Ｅ２抗原主要分布于肌纤维膜上，少量分布于肌纤维间，在细胞浆中很难检测到Ｅ２抗原；用ＨＣＶ基因疫苗免疫后１ｄ，Ｅ２抗原已有表达，１３ｄ抗原达高峰，以后逐渐减少，３０ｄ仪检测到少量抗原。     

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建…

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩＸ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ酶切法，ＰＣＲ和核酸探针法进行     

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—LacZ融合基因的构建

利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１基因的质粒ｐＢＳＴ２－６和含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ＰＵＣ１８，构建成ＳＴ１－ＬＡＣＺ融合基因。将质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和ＢｇＩＩＩ消化、碱性磷酸酶处理，最后将处理好的ＰＵＣ１８ ＤＮＡ与１４７ ｂｐＳＴ１ ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化不受体菌ＤＨ５Ａ中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴ１基因探针杂交     

白细胞介素—3对猪瘟病毒E2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明系小白鼠为试验动物，观察了白细胞介素－３（ＩＬ－３）对猪瘟病毒Ｅ２囊膜糖蛋白（ＨＣＶ Ｅ２）基因疫苗免疫效果的增强作用。用ＤＮＡ重组技术将ＨＣＶ Ｅ２基因和白小鼠ＩＬ－３基因克隆到ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ质粒，因在两者之间有脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ）的核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）片段，可得到ＨＣＶ Ｅ２抗体效价。结果显示，ＩＬ－３能显著提高ＨＣＶ Ｅ２基因疫苗的免疫效果，表明ＩＬ－３可作为ＨＣＶ Ｅ２     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的…

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒）、对病毒进行纯一提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆人ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ双酶切法、ＰｓｔＩ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，ａｑｔ     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明，ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）工程菌株可作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株     

鸡痘病毒282E4株Bam HI部分片段的重组载体质粒构建与序列分析

在中国鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组部分ＢａｍＨＩ片段的质粒ｐＵＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＤ２、ｐＵＥ和ｐＵＦ酶切分析的基础上,对ｐＵＦ进行了亚克隆获得ｐＵＦ－Ｅ和ｐＫＳ－Ｘ,对最可能存在非必需区的ｐＵＥ质粒进行了序列分析,改造了含Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,并在上述质粒的相应单一酶切位点插入Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,构建成ｐＵＢ１、ｐＵＦＣ１、ｐＵＦＥ１、ｐＵＦ－Ｅ１和ｐＫＳＦ－Ｘ１５个重组载体质粒。体内重组等工作正在进行中。     

传染性法氏囊病病毒VP2/VP0基因在重组鸡痘病毒中的表达

以鸡痘病毒复制非必需区ＴＫ基因为侧翼,在牛痘病毒Ａ型包涵体晚期启动子（ＡＴＩ）与１６个串联的突变型早期痘苗病毒ｐ７．５启动子组成的复合启动子的下游,分别插入编码传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）结构蛋白ＶＰ２和ＶＰ２－４－３（ＶＰ０）的基因片段后,进行了同源重组和蓝斑筛选,获得２株重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７和ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０。经ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７能表达ＶＰ２,ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０能表达ＶＰ２和ＶＰ３,ＶＰ２和ＶＰ３的Ｍｒ分别为４１０００和３２０００。     

IBDV VP2/VP243基因DNA疫苗表达质粒的构建与表达

将传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２／ＶＰ２４３插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ中,置于ＣＭＶ启动子的调控之下,构建成ＤＮＡ疫苗表达质粒ｐｃＤＮＡ ＶＰ２和ｐｃＤＮＡ ＶＰ０。分别转染ＣＥＦ细胞后,于２４、４８、７２ｈ取细胞裂解液进行ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,ｐｃＤＮＡ ＶＰ２于转染后２４ｈ呈阳性反应,４８ｈ表达量高于２４ｈ;ｐｃＤＮＡ ＶＰ０于转染后４８ｈ呈阳性反应     

传染性腔上囊病病毒超强毒致弱株GZ20 VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的５２／７０株传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）基因组序列,设计并合成了一对物异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２基因的引物。以超强毒ＩＢＤＶ（ｖｖＩＢＤＶ）致弱株ＧＺ２０基因组为模板利用技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物,将ＶＰ２基因克隆于ｐＵＣ１１９质粒上,得到重组ｐＵＣ１１９质粒。并对ＶＰ２基因全序列测定,序列分析和聚类分析表明,该致弱株与无毒疫苗株ＰＢＧ９８和弱毒株ＣＵ－１非常相似,而与经典强毒     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因光敏生物素探针的制备及初步应用

将重组质粒ｐＵＣＬａＦｃ和ｐＵＣＦ４６Ｆｃ用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ酶切,回收新城疫病毒融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因,将此Ｆｃ片段用光敏生物素标记,制备出Ｆｃ探针。该探针能够与新城疫病毒（ＮＤＶ）的强毒株Ｆ４６Ｅ９、中毒株Ｍ株和弱毒株ＬａＳｏｔａＥ４株杂交,而不与对照的传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒杂交,说明探针是特异的。用ｐＵＣＬａＦｃ的Ｆｃ探针检测了各５份ＮＤＶ强中弱毒株的尿囊液,均为阳性。但强毒株和弱毒株的Ｆｃ探针都能与所用的强、中、弱毒株杂交,说明该Ｆｃ探针尚不能区分强、弱毒株。     

新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析

采用异硫氰酸胍／酚／氯仿抽提一步法,提取新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９株及２个东北地区分离株ＤＢ３、ＤＢ５基因组ＲＮＡ,并以其为模板经反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第１链,再利用ＰＣＲ技术分段增出Ｆ基因的ｃＤＮＡ。Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和ＤＢ５株Ｆ基因的ｃＤＮＡ经酶切修饰后,插入ｐＵＣ１９的多克隆位点中,转化感受态Ｅ。ｃｄｉ ＤＨ５ａ,经相对分子质量比较、酶切分析及ＰＣＲ等鉴定方法筛选出Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和     

传染性支气管炎病毒中国地方分离株RFLP基因分型的研究

为初步确定我国不同地区流行的传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的基因分型，对分离自国内８个不同地域疫区的ＩＢＶＱＤ、ＧＺ、ＺＺ、ＴＪ、ＤＬ、ＹＣ、ＪＳ１和ＪＳ２及参考株Ｍ４１、Ｈ５２和Ｔ的Ｓ１基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增ｃＤＮＡ进行ＨａｅⅢ的ＲＦＬＰ分析。结果，ＱＤ与ＭＤ４１、Ｈ５２同属Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｅ基因型，ＧＺ、ＺＺ、ＹＣ与Ｔ的基因型相同，ＤＬ、ＪＳ１和ＪＳ２则表现为各自独立的基因型，而ＴＪ则为ＤＬ和Ｔ２种基因型毒株的混合感染，表明我国的广大地域内存在着Ｍａｓｓ基因型、Ｔ基因型和可能的变异株ＩＢＶ的流行。     

乙脑病毒PrME基因在杆状病毒表达系统中的表达

本试验将乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）的ＰｒＭ／Ｅ基因的ＨｉｎｄⅢ－ＢｇｌⅡ片段（２．１ｋｂ）插入到杆状病毒载体ｐＡｃＵＷ３１的ＢａｍＨＩ位点,使外源基因置于多角体蛋白启动予下游,构建成转移载体ｐＡｃＵＷ３１ＪＥ,以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ作为共转染试剂,将纯化的ｐＡｃＵＷ３１ＪＥ与Ｂｓｕ３６Ｉ线性化的杆状病毒ＡｃＭＮＰＶ．ＬａｃＺＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９经病毒蚀斑纯化技术和Ｘ－ｇａｌ与中性红双重染色技术,随机     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白菌株的构建

将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴⅠ）结构基因的质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍｍＨⅠ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＳＴⅠ基因片段，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨⅠ消化、碱性磷酸酶处理，然后将处理的ｐＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴⅠＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＤＨ５α。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴⅠ基因探针杂交阳性的菌株。杂文阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后，经限制性内切酶分析和ＤＮＡ序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴⅠ含有２个连接在一起的ＳＴⅠ基因片段，其连接方向是正向的，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴⅠ）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上呈蓝色菌落．表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆和鉴定

以鸡胚成纤维细胞培养ＩＢＤＶ弱毒疫苗株Ｄ７８，经蔗糖密度梯度离心纯化，电镜下见典型ＩＢＤＶ粒子。用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒基因组，低熔点胶回收，琼脂糖凝胶电泳，可见ＩＢＤＶ典型双节段基因组。根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＩＢＤＶＶＰ２基因的引物。以ＩＢＤＶ基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物，将ＰＣＲ产物适当处理后与经ＳｍａⅠ酶切的ｐＵＣ１９质粒平端连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，在含Ａｍｐ、Χ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ的琼脂平板上培养，产生大量白色菌落。挑取白色菌落，经质粒大小比较分析初步筛选到一重组质粒。以重组质粒ＤＮＡ为模板作ＰＣＲ检测和部分酶切分析证实，该质粒为含Ｄ７８ＩＢＤＶＶＰ２基因的重组ｐＵＣ１９     

鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析

以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。