鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析

以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。     

鸡贫血病毒DNA的PCR扩增及其分子克隆

用ＰＣＲ方法扩增了国内分离的鸡贫血病毒（ＣＡＶ）ＳＪ１株的含ＶＰ２、ＶＰ３以及部分ＶＰ１的１５００ｂｐＤＮＡ片段。经限制性内切酶酶切分析，该片段与Ｃｕｘ－１株的酶谱相似。同时，以ｐＵＣ１１９质粒载体克隆了这一ＤＮＡ片段。     

鸡传染性法氏囊病病毒野毒株VP2基因高可变区酶切位点分析

参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）００２７３ 毒株基因组序列设计的 １ 对引物,位于 Ｖ Ｐ２ 高可变区两端,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ,扩增了 ５ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 山东分离株 Ｖ Ｐ２ 基因的 ６０７～１ ０８０ 位核苷酸片段（ａａ２０３～３０６）。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经纯化后,分别用 Ｄｒａ Ⅰ、 Ｓａｃ Ⅰ、 Ｓｓｐ Ⅰ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓａｕ３ Ａ Ｉ共 ５ 种限制性内切酶（ Ｒ Ｅ）进行消化处理,结果 ５ 个分离株均为 Ｄｒａ Ⅰ（－ ）、 Ｓａｃ Ⅰ（－ ）和 Ｓａｕ ３ Ａ Ｉ（＋ ）, Ｌ Ｃ２ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（＋ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｊ Ｎ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（－ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｌ Ｃ２ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（＋ ）, Ｊ Ｎ、 Ｌ Ｌ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（－ ）;５ 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异,而 Ｔ Ａ 株与日本超强毒株 ９０１１ 相类似。５ 个分离株与现用疫苗株对比,至少在 Ｖ Ｐ２ 可变区内存在着一定的差异,这可能是 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 接种免疫鸡群仍然暴发 Ｉ Ｂ Ｄ 的原因之一。     

鸭源和鸡源减蛋综合征病毒（EDSV）酶切图谱的分析

选用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ和ＢｇｌⅠ进行鸭源减蛋综合征（ＥＤＳ）病毒（ＪＥ１株）和鸡源ＥＤＳ病毒（ＮＥ４株）的酶切图谱分析，发现鸭源ＥＤＳ病毒的这些酶切片段分别为９，４，４，６条，而鸡源ＥＤＳ病毒（ＮＥ４株）则为１０，４，４，５条，两者的酶切图形和片段大小有些不同，说明ＥＤＳ病毒宿主不同，即使血清型相同，基因型也有差异。     

含PRRS病毒ORF5的伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体的构建

提取伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）ＢａｒｔｈａＫ６１株基因组ＤＮＡ,用限制性内切酶ＫｐｎＩ充分消化,回收５．９ｋｂ片段（Ｊ片段）,将其克隆于质粒ｐＵＣ１１９ ＫｐｎＩ位点上,获得ｐＢＫＪ。用两对针对ＰＲＶ ＴＫ基因的特异性引物对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定,证明其中含有ＰＲＶ ＴＫ基因。然后用ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱。进一步研究证实ＴＫ基因位于其中的     

3株减蛋综合征病毒毒株核酸酶切谱分析

选用ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅤ、ＰｖｕⅡ、ＢｇｌⅠ、ＳｍａⅠ和ＰｓｔⅠ等８种限制性内切酶,对不同地区分离的３株减蛋综合征（ＥＤＳ）病毒进行酶切图谱比较。结果发现３株毒用前６种酶切割后产生的片段数及各片段的大小均相同,而用ＳｍａⅠ和ＰｓｔⅠ切割后,贵州分离毒ＨＳ－１与国际标准毒ＡＶ－１２７、南京他离毒ＧＣ２相比,多出１个片段。表明不同地区ＥＤＳ分离毒的核酸结构基本相同而又略有差异     

不同传染性法氏囊病病毒分离株VP2基因部分核酸序列及其编码蛋白的比较

根据已报告的传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列,在病毒 Ｖ Ｐ２ 区域,设计 １ 对引物,并在 ２ 引物上分别加 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ酶切位点。对 ２ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 分离株 Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４,用异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,然后进行逆转录和 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增片段经酶切纯化后克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中,以双脱氧链末端终止法测定 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列。将测定的分离株与标准对照株（ Ｓ１） Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ Ｖ Ｐ２ 基因片段的核苷酸序列进行计算机分析比较, Ｊ Ｓ３ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ３ 与 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９９％ 。推导编码蛋白氨基酸序列, Ｊ Ｓ３ 和 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９６％ , Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９８％ 。这表明在我国流行的 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 毒株与标准毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。     

鸡传染性支气管炎北京地方株S1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应技术从北京地区３株鸡性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎＩ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ１,ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ２和ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ３。     

禽呼肠孤病毒S1基因的扩增克隆与鉴定

利用反转录－聚合酶链（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,扩增出禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）Ｓ１１３３、１７３３长为５４０ｂｐ的Ｓ１基因片段。将扩增到的２个毒株的Ｓ１基因通过粘端连接分别克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ＋质粒中,用ＰＣＲ和限制性内切酶分析鉴定,表明获得２种重组质粒ＡＲＶ Ｓ１１３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ＡＰＶ １７３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ。     

伪狂犬病病毒糖蛋白gp50基因的克隆和表达

从包含伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）闽Ａ株ＢａｍＨＩ－７片段的重组质粒ｐＰＲ１２８中分离出含有完整糖蛋白ｇｐ５０基因的２．１ｋｂＤＮＡ片段，用ＫｐｎＩ和ＳｔｕＩ酶切后，将其酶切片段分别克隆到ｐＵＣ１９载体中，构建了２．１ｋｂ片段完整测序用质粒。对其序列进行分析，发现与文献报道结果一致，证明分离的ｇｐ５０基因是正确的。将包含ｇｐ５０基因的２．１ｋｂ和１．６ｋｂＤＮＡ片段分别插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的ｐＧＪＰ－５质粒Ｐ７．５启动子的下游，构建了ｐＧＢＴ５０－３６和ｐＧＢＴ５０－Ｓ２２个嵌合载体。将嵌合载体通过磷酸钙共沉淀法转染预先感染ＴＫ＋痘苗病毒天坛株的人ＴＫ－１４３细胞或ＣＶ－１细胞，进行体内同源重组。经蚀斑纯化，在ＢｄＵＲ选择压力下，通过光敏生物素标记的探针杂交，获得带有ＰＲＶｇｐ５０基因的重组痘苗病毒。用ＥＬＩＳＡ检测，重组痘苗病毒有特异性ＰＲＶｇｐ５０抗原存在。     

产蛋下降综合征（EDS—76）病毒DNA酶切图谱分析

选Ｅｃｏ，Ｒｉ，Ｐｓｔ，Ｉ，Ｐｖｕ ＩＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｂｇ１Ｉｔ和Ｂｇ１ＩＩＩ６种限制性内切酶，对国内４株ＥＤＳ－７６病毒鸡源分离株和国外标准株ＡＶ－１２７及１株鹅源腺病毒的ＤＮＡ进行酶切图谱的比较，结果发现４种鸡源分离株子ＡＶ－１２７株用上述６种酶切的片段数分别为４，８，１０，１０，６和７条。各酶切图形，片段大小亦十分相似，表明均为ＥＤＳ－７６病毒。ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ和Ｐｓｔ－Ｉ－Ｅｃ     

狂犬病病毒糖蛋白转基因小鼠的构建研究

将狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ ＢｇｌⅡ（１．６７ｋｂ）片段正向插入ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋ＢａｍＨⅠ切点，构建重组质粒ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋－Ｒｇｐ，用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ对ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋－Ｒｇｐ进行双酶切后，回收含有狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ和绵羊ＭＴ启动子的２．７６ｋｂ片段，通过显微注射技术将该片段注入小鼠单细胞受精卵雄前核内，在进行胚胎移植后，获得４４只小鼠，经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及原位     

用PCR技术从同一兔出血症病料扩增和检出2种病毒核酸

应用 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术，对兔出血症病毒核酸作了鉴定。分别设计合成 ２ 对 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增特异性引物，即按兔出血症病毒中国分离的 Ｎ Ｊ株核酸序列合成 １ 对引物（ Ｎ Ｊ引物），按德国分离的 Ｆ Ｒ Ｇ 株核酸序列合成另 １ 对引物（ Ｆ Ｒ Ｇ 引物），进行 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ。从纯化的病毒核酸样品和感染 Ｄ Ｊ Ｒ Ｋ 细胞的病毒核酸样品中，均扩增出 ２ 对引物范围内的特异性核酸片段， Ｎ Ｊ引物扩增产物为 ３６４ ｂｐ， Ｆ Ｒ Ｇ 引物扩增产物为 ５１３ｂｐ。模板用 Ｒ Ｎａｓｅ 消化后，仍出现 ３６４ ｂｐ 带，用 Ｄ Ｎａｓｅ Ｓ１ 消化，则此带消失；反之，用 Ｄ Ｎａｓｅ Ｓ１ 消化，出现５１３ ｂｐ 带，用 Ｒ Ｎａｓｅ 消化，则此带消失，证实前者模板为 Ｄ Ｎ Ａ，后者为 Ｒ Ｎ Ａ。 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交试验证实， Ｐ Ｃ Ｒ扩增出的核酸片段与各自的地高辛标记特异性探针发生强阳性杂交反应。由此认为，在兔出血症病毒感染中，同时存在着 ２ 种不同核酸型的病毒。     

马铃薯SGAs合成代谢途径末端SGT酶基因克隆及序列分析

 糖苷生物碱（ＳＧＡｓ）是一类存在于茄科植物和百合科植物的重要次生代谢物,与植物抗逆性和产品品质有密 切关系,同时在医药上具有广泛的药理学活性。茄啶：糖基转移酶（ＳＧＴ）为ＳＧＡｓ合成代谢途径末端关键酶,研究 其基因结构及其编码的酶蛋白特性,对于调控植物体内ＳＧＡｓ合成及其通过微生物发酵生产ＳＧＴｓ有重要的作用 和意义。通过生物信息学分析方法预测３个糖基转移酶ｃＤＮＡ 编码的酶蛋白结构和特性。以马铃薯块茎表皮总 ＲＮＡ 为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ 的方法扩增出３个糖基转移酶（ＳＧＴ１、ＳＧＴ２和ＳＧＴ３）基因片段并克隆到ｐＭＤＲ１９ Ｔ 载体。阳性克隆经ＰＣＲ 鉴定后进行测序,序列分析结果表明,克隆到的sgt １、sgt ２ 和sgt ３ 三个同源的序列片段 （１４６７～１５１８ｂｐ）,编码４８８～５０５ 个氨基酸;所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ 中注册的高等植物ＳＧＴ 酶基因核苷酸序列 （Ｕ８２３６７．２、ＤＱ２１８２７６．１和ＤＱ２６６４３７）的同源性均在９９．１２％以上,氨基酸同源性达到９９％以上,３个基因都具 有ＵＤＰＧ 糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;ＰＩ为５．５２～５．６２。三级结构预测表明,该氨基酸同糖基转 移酶单体结构模型相似,都为糖基转移酶家族成员,具有合成类固醇糖苷生物碱的功能,基因序列已注册到Ｇｅｎ Ｂａｎｋ,序列注册号分别为：sgt １,ＪＮ６９５００５;sgt ２,ＪＮ６９５００６;sgt  ３,ＨＭ１８８４４７。     

禽腺病毒贵州分离株ＨＳ—１的核酸酶切分析与蛋白抗原鉴定

本研究利用１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗestern-Blotting技术鉴定３株不同的减蛋综合征病毒（贵州株ＨＳ－１、南京分离毒ＧＣ２、国际标准毒ＡＶ－１２７）的蛋白抗原性，结果表明，３株毒的蛋白多肽分子量均在１０６－１２kＤ范围,一各条多肽的组成上略有差异；它们都具有两条相同的免疫原性多肽，分子量分别为１０６和１００ＫＤ。同时，运用ＥcoRⅠ,HindⅢ，ＰｓｔⅠ和ＳmaⅠ等５种限制性内切酶进行了酶切分析，证实３株ＥＤＳ病毒用ＰstⅠ和ＳmsⅠ酶切的片段大小及长度略有不同，而其它３种酶的酶切图谱完全相同。     

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA酶切图谱分析

选用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅠ和ＢｇｌⅡ６种限制性内切酶，对国内４株ＥＤＳ－７６病毒鸡源分离株和国外标准株ＡＶ－１２７及１株鹅源腺病毒的ＤＮＡ进行酶切图谱的比较，结果发现４种鸡源分离株与ＡＶ－１２７株用上述６种酶切的片段数分别为４、８、１０、１０、６和７条。各酶切图形、片段大小亦十分相似，表明均为ＥＤＳ－７６病毒。ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔＩ－ＥｃｏＲＩ的双酶切也得到同样结果。鹅源分离株的酶切片段数分别为６、７、９、７、４和１０条，酶切图形和片段大小均与ＡＶ－１２７有很大不同，表明该分离株可能为１株血清型相同而基因组不同的ＥＤＳ－７６鹅腺病毒。     

用PCR扩增DNA限制性分析检测牛精液中胎儿弯杆菌

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和限制性核酸内切酶分析（ＲＥＡ）对牛精液中胎儿弈杆菌进行快速筛选，是对传统增减分离法的有效补充。选择胎儿弯杆菌１６ＳｒＲＮＡ高变区寡核苷酸配对引物（Ｃ１／Ｃ２）用ＰＣＲ扩增３６２ｂｐ片段。完成一次ＰＣＲＴ／ＲＥＡ过程需１０小时，对实验感染公牛的精液及用牛或蛋黄－－Ｔｒｉｓ（ＥＹＴ）稀释的业液的检测敏感性为３个胎儿弯曲杆菌性病亚种菌体。本试验对胎儿弯杆菌两个亚种及其它一些弯杆     

我国猪繁殖和呼吸综合征病毒基因型鉴定

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从我国东北和华北地区分离的２个猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）毒株中扩增获得部分核衣壳蛋白基因。该基因片段长度与美洲型野毒株ＶＲ２３３２ＲＴ－ＰＣＲ扩增片段相同,均为４３３ｂｐ,长于欧洲型Ｌｅｌｙｓｔａｄ毒株扩增片段长度（３９５ｂｐ）。此外,用另１对引物,从这２个分离毒株及ＶＲ２３３２毒株扩增获得部分ＧＰ５蛋白基因,其限制性酶切片段长度多态性分析结果相同或相似。该结果表明,我国不同地区流行的ＰＲＲＳＶ可能属于同一毒株,并且来源于美洲。     

鸡贫血病毒国内分离株的酶切图谱多态性分析

用套式PCR 扩增了鸡贫血病毒(CAV)长度为687 bp 的特异片段,以Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ、Hpa Ⅱ分别酶切,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了其限制性酶切片段的多态性。对几株国内外分离株的分析表明,TK5803和山东分离株SJ1、SJ2 应属于Todd 的限制性内切酶酶切图谱多态性分析法(RFLP)分类中的第2 组;吉林JL1 株和哈尔滨CL1 株相同,但与其他任何毒株均不相同,大连DL1 株也不同于任何现有毒株,因而都不能归属于Todd 划分的7 个小组;荷兰弱毒株与目前发现的所有毒株均不同,具有其特征性的酶切图谱。     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性敢管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列，应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２，分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行了ＰＣＲ扩增，结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增产生４５７ｂｐ的特异性片段，而ＴＫＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ