phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌的毒力调控作用

phoP/Q作为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性。本研究拟探讨phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)的生长、定植、毒力等生物学特性的影响。利用Red重组系统构建APEC AE 17株的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并构建phoP/Q双组分调控系统回复质粒,转化缺失株,构建回复株。通过生长运动性试验、黏附入侵CEF细胞试验、毒力基因转录水平检测以及半数致死量(LD50)等试验比较野生株、缺失株、回复株的生物特性。与野生株相比,phoP-phoQ缺失不改变其生长特性;运动性较野生株下降63%;黏附与入侵CEF细胞能力分别降低69.83%(P0.01)和62.17%(P0.05);LD50显示毒力减弱13.3倍;polA、tsh基因转录水平分别上调41%、54%;sodA、iss分别下调64%和98%。phoP/Q双组分系统参与对APEC致病性的调控,该系统的缺失会降低APEC的致病性。     

摄铁系统及自分泌毒素对猪源肠外致病性大肠杆菌毒力发挥的影响

为了探究猪源肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)的致病机制，本研究通过小鼠感染模型筛选强毒菌株，以PU-1为强毒代表株进行全基因组测序(染色体登录号CP042246,质粒登录号CP042245)及分析，以铁摄取系统及自分泌毒素为关注点探究上述毒力因子在PU-1株中的编码情况，并构建单基因或多基因缺失株，探究摄铁系统及自分泌毒素在猪源ExPEC致病过程中的作用。结果显示：摄铁系统及自分泌毒素基因在血液定殖的细菌中不同程度上调，最高上调可达11倍；铁摄取系统相关基因缺失株fyuA-ybtQFX、ΔiroBCDEN、Δfur及ΔsitABCD^Both对感染小鼠的致病力与野生株相比显著减弱，在感染动物血液载菌量不同程度下降，最高下降至野生株的1/15左右；自分泌毒素相关基因缺失株Δvat及ΔcdtABC对感染小鼠的致病力与野株相比显著减弱，在感染动物血液载菌量下降至野生株的1/2左右。上述结果表明，摄铁系统FyuA-YbtQFX、IroBCDEN、SitABCD及SitABCD-Plas...     

双组分系统CpxR影响禽致病性大肠杆菌的耐药性、抗血清杀菌能力及毒力

CpxR是细菌中Cpx双组分系统（two component system,TCS）的反应调控蛋白,通过调控靶基因的转录表达,在细菌细胞膜稳定及毒力方面发挥作用。本研究旨在探究TCS CpxR对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）基本生物学特性、抗血清杀菌能力及致病性的影响。利用Red同源重组系统及互补质粒构建cpxR基因缺失株、互补株,然后比较分析野生株、基因缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、药物敏感性、抗血清杀菌能力、动物致病性的差异。结果显示：cpxR基因缺失株与野生株、互补株的生长速度和运动性能无明显差异,且缺失cpxR基因不影响APEC的生物被膜形成能力。然而,缺失CpxR导致APEC对阿米卡星和卡那霉素耐药性降低。血清杀菌试验结果显示,CpxR有助于APEC的抗血清杀菌能力。动物感染试验结果显示,野生株、cpxR基因缺失株和互补株对雏鸭的半数致死量（LD₅₀）分别为7.50×10⁵、7.50×10⁶、1.33×10⁶ CFU,表明CpxR缺失显著降低APEC的毒力。综上表明,TCS CpxR在APEC耐药性、抗血清杀菌能力及毒力方面发挥作用,为阐明APEC的环境适应性、生存能力及致病机制提供参考。     

Ⅵ型分泌系统分泌蛋白ClpV对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究clpV对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组构建了APEC DE17株的clpV缺失株DE17ΔclpV及其回补株DE17CΔclpV,比较分析了野生株、缺失株和回补株的生长曲线,运动性和生物被膜(BF)形成能力;对DF-1细胞的黏附、侵入能力以及通过荧光定量PCR检测clpV缺失后对Ⅵ型分泌系统(T6SS)相关基因转录水平的影响。结果显示,通过Red同源重组构建了clpV基因缺失株与回补株,利用分光光度计测OD600nm绘制野生株、缺失株和回补株的生长曲线。结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV生长速率无明显变化;其运动和BF形成能力的检测结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV的运动能力降低(p0.05),而其BF形成能力则升高(p0.05);分别将DE17、DE17ΔclpV和DE17ΔclpV感染DF-1细胞,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV对DF-1细胞的黏附能力升高(p0.01),而侵入能力减弱(p0.01)。荧光定量检测结果显示,与野生株相比,clpV缺失株csgD、icmF、lip和hcp基因的转录水平升高(p0.05),而vgrG和rpoD基因的转录水平降低(p0.05)。本研究结果表明,T6SS的分子伴侣ClpV影响APEC的生物学特性,为进一步研究T6SS的功能及其致病机制提供参考。     

江苏部分地区禽致病性大肠杆菌分离株的生物学特征及耐药性研究

为了解江苏部分地区禽致病性大肠杆菌(APEC)的分子流行状况,从临床分离鉴定出120株APEC,并对分离株的血清型、种系发生型、毒力基因型和耐药性进行检测。血清型检测结果显示,在已定型的95株分离株中,最常见的血清型为O78,约占定型菌株比例为27.4%,其他主要血清型还有O18、O24和O88等。APEC分离株种系发生型以B2型和D型为主,分别占受试分离株的35.6%和28.5%,而A型和B1型分别占22.8%和13.1%。对已知的12种毒力基因的检测发现,铁摄取基因的检出率相对较高,如tonB(93.3%)、iutA(90.8%)、iroN(84.2%)和feoB(82.5%),其他受检基因fimH、iss、cvaC和traT的检出率也在70%以上,而hlyD、papC、irp-2和tsh基因在APEC菌株中的检出率低于30%。筛选40株分离株进行1日龄雏鸡致病力试验,确定出高致病株和低致病株分别占65%和35%。进一步分析发现高致病株比低致病株检出率高的毒力因子有iutA、tsh、iroN、irp-2、iss和cvaC(P<0.05),提示这6种毒力基因可作为鉴别APEC毒...     

细胞溶素HlyE变体对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究细胞溶素HlyE突变体(HlyE-V)对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病力的影响，采用Red同源重组法构建了APEC菌株CBE59的HlyE-V基因缺失株CBE59ΔHlyE-V和回补株CBE59CΔHlyE-V,测定缺失株生长曲线、溶血活性、胞内存活曲线，并用细胞毒性试验和动物试验来评估HlyE-V对APEC致病力的影响。结果表明∶缺失HlyE-V基因对APEC的生长速率影响较小，野生株、缺失株和回补株均无溶血活性，证明HlyE-V不是孔道形成毒素，不能溶解哺乳动物的红细胞；HlyE-V缺失株致细胞毒性和对雏鸡的致病力显著降低，缺失株的半数致死量(LD₅₀)值为4.9×10⁶CFU/只，而野生株和回补株的LD₅₀分别为8.2×10⁵CFU/只、4.2×10⁵CFU/只；在HD11巨噬细胞内的存活能力显著下降，在野生株CBE59感染的HD11中有一半的细胞中含有6～8个细菌，且有56.7%的细胞中观察到超过6个细菌；而在观察缺失株CBE59ΔHlyE-V时，菌量超过6个...     

伴侣蛋白Hfq对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究小RNA(sRNA)伴侣蛋白Hfq在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染致病过程中的作用,本研究采用Red同源重组法构建了禽致病性大肠杆菌FY26的hfq缺失株FY26Δhfq,通过测定缺失株生长曲线、生物被膜形成、体内定殖、胞内存活等能力来判定sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC致病力的影响。在体外,生物被膜形成能力直接决定着细菌对外界环境的抵抗能力,而在细菌进入体内后,其生长速率、黏附、定殖、吞噬细胞内的存活等能力均会直接影响其致病力。在进行了缺失株FY26Δhfq与野生株FY26的生长曲线测定试验、生物被膜形成能力测定试验、感染雏鸡试验、雏鸡体内定殖与侵袭试验、DF-1细胞黏附及HD11吞噬细胞内存活试验后,结果表明：hfq缺失株相较野生株其生长速率下降,生物背膜形成能力降低了18.6%,感染雏鸡时毒力降低,感染7 d后存活率为80%,在雏鸡体内定殖侵袭减弱,体内竞争能力下降至33.2%,对DF-1细胞的黏附能力降低,HD11吞噬细胞内的存活能力下降,单个细胞内存活的细菌数大多少于6个。研究表明,sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC的致病力起着关键的正向调控作用。     

WzxE蛋白影响鸡白痢沙门氏菌致病性的研究

wzx/wzy是调控革兰氏阴性菌O抗原合成的主要途径,对细菌的生存、代谢乃至致病性均具有重要作用。为研究该基因簇中wzxE基因对鸡白痢沙门氏菌致病性的影响,本研究通过同源重组方法构建了鸡白痢沙门氏菌参考菌株ATCC19945的wzxE基因缺失菌株(ATCC19945 ΔwzxE),通过生长特性试验、应激试验、细菌蛋清存活能力测定、1日龄雏鸡感染试验对比基因缺失突变株与野生菌株、回补株的生物学特性及分析WzxE蛋白功能。结果显示,wzxE基因缺失并未影响白痢沙门菌的生长特性。应激试验显示,wzxE基因缺失会导致鸡白痢沙门菌在酸性和H_2O_2处理条件下生存能力的显著下降,回补之后得到明显回复。细菌蛋清存活能力检测结果显示,wzxE基因缺失株较野毒株在蛋清内的存活能力下降明显,回补之后存活能力显著增强。1日龄雏鸡感染试验结果显示,鸡白痢沙门菌ATCC19945野生菌株、wzxE基因缺失株和回补株对雏鸡的半数致死量分别为1. 65×10~8cfu、4. 67×10~8cfu和3. 43×10~8cfu,毒力下降不明显。提取鸡白痢沙门菌参考株和缺失株LPS,经SDS-PAGE后银染检测显示,wzxE缺失不影响鸡白痢沙门菌LPS总体成分构成,但影响特定LPS特定寡糖单位的含量。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门氏菌细菌毒力的影响因素、疫苗开发奠定基础。     

肠炎沙门菌C50336ZinT基因缺失株构建及其相关生物学特性

为研究锌调控蛋白ZinT在肠炎沙门菌致病中的作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)ZinT基因缺失突变株(C50336ΔZinT),并对其生物学特性进行分析。结果显示,与野生型菌株和回复菌株相比,缺失株C50336ΔZinT在LB培养基中生长速度无明显差异,生化特性亦无明显变化,但其在Minimal培养基中生长明显变慢。此外缺失株C50336ΔZinT对H_2O_2处理和高渗环境的适应能力显著下降,但在巨噬细胞内的存活率无明显降低。动物试验表明,ZinT基因缺失突变株的毒力和野生型菌株相比仅有轻微下降。本试验探讨了ZinT与肠炎沙门菌锌摄取和毒力间的联系,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析内化素InlK对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性及致病性的影响,利用自杀性质粒进行同源重组构建LM标准菌株10403s的inlK基因缺失株,然后比较分析野生株、inlK基因缺失株的生长特性、生物被膜形成能力、细胞侵袭能力、动物致病力等差异。结果显示,inlK基因缺失不影响LM的生长速度,但可导致LM的生物被膜形成能力下降。细胞感染试验表明基因缺失株ΔinlK对RAW264.7细胞的侵袭及胞内存活能力分别下降了18%和31%。动物感染试验显示野生株和基因缺失株ΔinlK对小鼠的致死率分别为80%(4/5)和40%(2/5),且基因缺失株ΔinlK的体内定殖能力显著低于野生株。本研究表明内化素InlK在LM感染过程中发挥着重要作用,为了解LM的致病作用提供参考。     

非编码小RNA(RyhB)调控禽致病性大肠杆菌毒力相关基因的分析

以小RNA(RyhB)为研究对象,探索RyhB对禽致病性大肠杆菌相关毒力基因的调控研究。采用Red同源重组技术构建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及构建出回复株△RyhB-comp。运用活菌计数法分别观察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力,并且利用Real-time PCR检测AE17、△RyhB和△RyhB-comp的8个毒力基因转录水平。结果成功构建出了基因缺失株△RyhB和回复株△RyhBcomp,△RyhB黏附细胞能力较AE17均有显著地降低,约为AE17的62.5%,△RyhB-comp较△RyhB黏附能力显著上升,为△RyhB的1.4倍。同时,Real-time PCR结果显示,△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的转录水平均极显著下降(P0.01),其mRNA转录水平分别约为AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%;△RyhB的iss、ibeA毒力基因表达水平分别上调约1.14倍和1.2倍。表明RyhB的缺失能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使毒力基因的转录水平有所降低。根据以上结果,推测RyhB对APEC的毒力具有极其重要的调节作用。     

迟缓爱德华菌menF基因缺失株的构建及生物学特性研究

为研究异分支酸合成酶MenF在迟缓爱德华菌(E.tarda)致病中的作用,本研究利用自杀载体构建了E.tarda menF基因缺失菌株(ET-CLΔmenF),并分析其生物学特性。结果显示,ET-CLΔmenF株比野生菌株生长减缓。体外应激试验结果表明,ET-CLΔmenF菌株对铁饥饿的耐受能力明显下降,应对酸性和过氧化氢处理的能力显著下降。细胞感染实验表明ET-CLΔmenF菌株的胞内存活能力显著下降(p0.01)。对斑马鱼的致病性结果表明,ET-CLΔmenF株毒力下降。本研究为E.tarda致病机制研究以及疫苗的研制提供了参考。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...     

肠炎沙门菌双组份系统qseC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框内缺失突变技术成功获得肠炎沙门菌C50041ΔqseC缺失株,以野生株C50041、回复株C50041ΔqseC::qseC为对照,发现C50041ΔqseC缺失株的生化特性、生长曲线与C50041野生株一致,但其运动性(P=0.001 9)以及对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.032 5)、侵袭率(P=0.005 3)相比野生株显著下降。研究提示:qseC基因的缺失对肠炎沙门菌的生化特性和生长曲线没有影响,但会显著降低肠炎沙门菌的运动能力及对宿主细胞的黏附和侵袭。研究初步探究了肠炎沙门菌qseC基因的功能,为后续深入研究奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌唾液酸酶siaK1基因缺失株的构建及其生物学特性分析

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是危害养禽业发展的重要病原之一。本试验利用Red同源重组技术构建APEC IMT5155唾液酸酶基因sia K1缺失株和互补株,系统比较其生物学特性的差异。生长曲线测定表明,缺失株比野生株和互补株生长速度加快,而野生株和互补株的生长速度无明显差异;生物被膜形成能力测定表明,sia K1缺失导致细菌生物被膜形成能力显著减弱,而互补株可恢复至野生株水平,说明sia K1基因缺失可影响禽致病性大肠杆菌的生长速度及生物被膜的形成。本研究为进一步探讨sia K1基因功能奠定了基础。     

禽源肠炎沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

试验旨在研究aroA基因对肠炎沙门菌生物学特性及毒力的影响。利用λ-Red同源重组技术，将从田间分离的禽源肠炎沙门菌的aroA基因进行敲除，经连续传代检测缺失株遗传稳定性，并通过细菌生长曲线、对不同生化反应管的利用情况、生物膜形成能力、对环境应激的抵抗能力及对1日龄雏鸡的毒力比较野生株和基因缺失株之间的差异。结果显示，试验成功构建缺失株，连续传30代未发现目的基因回复突变；在相同培养条件下，缺失株与野生株在相同时间进入对数生长期和稳定期，但缺失株生长速率低于亲本株；缺失株较野生株生化特性未发生改变；缺失株的生物膜形成能力及对酸、碱、高渗和热应激的抵抗能力均显著低于野生株（P<0.05）；1日龄雏鸡分别滴口接种缺失株和野生株，观察14 d，野生株组鸡全部死亡，而缺失株组无死亡。综上所述，本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的肠炎沙门菌aroA基因缺失株，缺失株生化特性和体外生长趋势未发生明显改变，但生物膜形成能力、对环境应激抵抗能力及毒力均明显下降。本研究为进一步研究肠炎沙门菌aroA基因缺失株的免疫原性奠定了基础。     

禽致病性大肠杆菌phoP/phoQ基因敲除株的构建及其毒力基因转录调控的研究

为研究Pho P/Q二元调控系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病性的调控作用,本研究采用Red同源重组技术分别构建了APEC AE17株的pho P基因敲除株AE18和pho Q基因敲除株AE19,并通过p STV-28质粒分别构建pho P和pho Q基因回补株CAE18和CAE19。并对这些菌株的运动能力、对鸡胚成纤维细胞(CEF)的黏附和侵入能力以及其13个毒力基因的转录水平进行了检测。结果表明,pho P和pho Q基因敲除株运动性能力分别为AE17的70.92%和83.83%;黏附和侵入CEF细胞的能力比AE17均极显著降低,分别为AE17的63.11%、65.42%和59.83%、57.82%。荧光定量PCR结果显示,AE18的毒力基因(sod A、pol A和iss)和AE19的毒力基因(fim C和iss)比AE17相应的毒力基因m RNA的转录水平均呈极显著下降(p0.01)。此外,回补株CAE18和CAE19株能够部分恢复运动性能力、黏附和侵入CEF细胞的能力及相关毒力基因的转录水平。结果表明pho P和pho Q基因的敲除均能够显著改变APEC AE17株相关的生物学特性,并且能够调控毒力基因的转录水平,使其毒力显著下降。本研究为进一步了解APEC的Pho P/Q二元调控系统对其致病性影响提供实验依据。     

副鸡禽杆菌毒力质粒缺失株的构建及其致病性的研究

为研究副鸡禽杆菌(APG)质粒与菌株致病力的关系，本研究采用42℃诱导的方法缺失APG分离株APG-Hu中的毒力质粒，经PCR鉴定质粒缺失菌株后将其命名为APG-HuΔ。分别采用分光光度计测定OD600nm值法、微量生化鉴定管法、K-B纸片法和雏鸡感染试验测定APG-HuΔ的生长曲线、生化特性、药物敏感性和对雏鸡的致病性。结果显示，在42℃诱导条件下，能够有效缺失APG-Hu中的毒力质粒p250和p A14，而质粒p YMH5未被缺失；APG-HuΔ生化特性、生长曲线及耐药性与APG-Hu相比均无明显差异。雏鸡感染试验结果显示，多数APG-HuΔ感染鸡无明显临床症状，总体发病情况明显弱于同等剂量APG-Hu感染的鸡，表明APG-HuΔ毒力显著降低。本研究结果表明，APG毒力与质粒p250和p A14相关，而质粒p YMH5可能增加APG耐受多种抗生素的风险。本研究为APG致病机理及耐药机制研究奠定基础，也为挖掘APG质粒的应用潜力提供一定参考。     

弓形虫Tgcsp2基因敲除株的表型和毒力

为研究弓形虫冷休克蛋白2(cold shock domain protein 2 of T.gondii,Tgcsp2)在弓形虫感染宿主过程中的作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫Tgcsp2基因缺失株(ΔTgcsp2)。通过空斑试验和细胞裂解试验探究ΔTgcsp2虫株在体外的生长能力,结果表明ΔTgcsp2虫株的空斑形成能力和细胞裂解能力相对于RH野生株较弱;弓形虫感染细胞要经过入侵、复制和逸出3个过程。为探究Tgcsp2影响体外感染的具体过程,本研究对ΔTgcsp2虫株和RH野生株进行入侵试验、复制试验和逸出试验,结果表明ΔTgcsp2虫株的入侵能力、复制能力和逸出能力都有不同程度的减弱;将ΔTgcsp2虫株和RH野生株感染BALB/c小鼠进行了体内毒力试验;结果表明,与RH野生株相比,ΔTgcsp2虫株对小鼠的毒力减弱。综上所述,Tgcsp2基因对弓形虫体外生长和体内毒力具有重要的作用。     

前噬菌体对禽致病性大肠杆菌DE205B环境耐受力的影响

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)DE205B基因组中存在前噬菌体phiv205-1。本文利用RED同源重组技术构建前噬菌体phiv205-1缺失株,采用倍比稀释的方法检测野生株DE205B和前噬菌体缺失株DE205BΔphiv205-1在酸、盐和氧化应激等不利条件下的存活率,分析前噬菌体对APEC环境适应力的影响。结果显示,与野生株相比,前噬菌体缺失株DE205BΔphiv205-1酸性耐受力下降了56.62%(P0.001),在氧化应激条件下的存活率下降了91.78%(P0.001)。为研究前噬菌体phiv205-1中影响宿主细菌对酸和氧化应激耐受的基因,采用real-time PCR检测了部分phiv205-1基因在氧化应激环境中的表达量,结果显示基因2971、2989、3327及Erf的表达量显著升高。进一步构建了Δ2971、Δ2989、Δ3327及ΔErf的单基因缺失株,环境耐受实验结果显示,与野生株相比,单基因缺失株Δ2971、Δ2989、Δ3327及ΔErf在H_2O_2环境下的存活率依次降低了89.32%、67.79%、27.84%和71.29%。研究表明,前噬菌体phiv205-1增加了细菌对环境压力的抵抗力,为宿主菌在恶劣条件下的生存提供了多种益处。