猪流行性腹泻病毒S蛋白多表位抗原免疫原性分析

在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株CV777毒株S基因基础上,选取S抗原优势表位EP(499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa和1368～1374 aa)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因,优化后通过编码柔性连接肽(G...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位区基因克隆、分析及原核表达

从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,Western blotting鉴定,结果表明该抗原表位区蛋白得到了重组表达.该研究可为PEDV抗原表位区的相关研究提供参考.     

携带猪流行性腹泻病毒抗原表位的铁蛋白纳米颗粒制备与免疫原性分析

【目的】制备携带猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫原性,为PEDV的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】将PEDV纤突蛋白S的COE和S1D区域设计成串联表位S1CD并进行密码子优化和合成,构建单独表达S1CD蛋白的重组质粒pET28a-S1CD及融合表达S1CD蛋白和铁蛋白亚基的重组质粒pET28a-S1CD-Ferritin,并在大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1CD、S1CD-Ferritin蛋白在大肠杆菌内是否正确表达,并通过透射电镜观察其形态结构。将纯化的S1CD-Ferritin蛋白免疫小鼠,同时以纯化的S1CD蛋白和PBS为对照,采用间接ELISA方法检测各组小鼠血清的S特异性抗体水平和γ-干扰素(IFN-γ)含量,通过中和试验测定中和抗体水平,分析重组蛋白在小鼠体内的免疫原性。【结果】成功构建了重组质粒pET28a-S1CD和pET28a-S1CD-Ferritin。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了S1CD...     

猪流行性腹泻病毒COE蛋白的原核表达及免疫原性分析

为表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原表位COE蛋白,分析其免疫原性,为PEDV的检测和亚单位疫苗的开发奠定基础.参考GenBank中PEDV COE基因序列,人工合成并经生物信息学综合分析后,将合成的基因片段插入原核表达载体pET-32a(+),构建...     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白抗原表位区的表达及其免疫原性分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白(S)上主要抗原位点的免疫原性,本研究将S基因上A、B、C、D四个位点进行RT-PCR扩增,构建重组质粒pET30a-S,诱导表达后Western-blot检测,表明目的蛋白具有良好的抗原性。将纯化的目的蛋白免疫小鼠3次,在初次免疫后第0,14,28,42天采血,并用间接ELISA方法监测血清抗体动态水平变化。结果表明,获得的重组蛋白能诱导免疫小鼠产生特异性的体液免疫,说明该蛋白具有发展成TGEV亚单位疫苗的潜力。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S基因与SEA基因融合表达及免疫原性评价

试验旨在构建pET-28a-S-SEA融合表达质粒,并评价S-SEA蛋白的免疫原性。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,对我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株(GenBank:LT906620.1)的S基因与金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因(GenBank:MH053151.1)进行优化,通过柔性连接肽(GGGGS)连接后,克隆至表达载体pET-28a,得到pET-28a-S-SEA重组质粒,转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测后,对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,将亲和层析后的重组蛋白,免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,对免疫小鼠的血清特异性抗体水平和淋巴细胞增殖指数进行检测。结果成功构建pET-28a-S-SEA质粒,且在大肠杆菌中获得高效表达;小鼠试验结果表明,纯化的S-SEA蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,促进淋巴细胞增殖,具有良好的免疫原性,为进一步研究猪流行性腹泻亚单位疫苗提供帮助。     

猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白在杆状病毒中的表达及免疫原性分析

为了研制一种有效控制猪流行性腹泻的疫苗,本试验设计了两对引物,分别扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要抗原表位S1(S蛋白中一个有效的抗原位点)和M蛋白的基因。将两段基因克隆到杆状病毒双表达载体pFastBacTMDuai中,构建了重组转移质粒pFBD-S1-M,并将其转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组穿梭质粒Bacmid-S1-M,转染Sf9昆虫细胞后,拯救出能够共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid-S1-M。表达产物经过SDS-PAGE和Western blot检测,共表达的重组S1和M蛋白产物能够与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,表明共表达的蛋白具有良好的反应原性。本研究为PEDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原(HBcAg)为载体呈现猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1抗原表位的病毒样颗粒.将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域(MIR),构建重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SD...     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白表达及反应原性分析

为了获得反应原性较好的猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白,利用原核表达系统对S1基因(60~845 bp)进行扩增并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),以1 mmol/L IPTG诱导表达4 h,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:成功构建了pET-30A-S1质粒,重组蛋白得到了表达且具有良好的反应原性,能够被兔PEDV多抗血清识别。本研究为进一步建立ELISA检测方法和亚单位疫苗的研制奠定了物质基础。     

1株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白的抗原表位,本研究通过原核表达N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合和亚克隆技术,筛选出1株稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞9B4。经鉴定单克隆抗体9B4的亚型为IgG1型,轻链为Kappa链。腹水抗体ELISA效价为10~6以上。ELISA、Western blot和免疫荧光鉴定结果显示该单克隆抗体反应原性和特异性良好。利用噬菌体展示技术对单克隆抗体9B4进行抗原表位鉴定,获得4个N蛋白的模拟抗原表位(C11、C12、C14和C26)。随后分别以噬菌体阳性克隆为模拟抗原,对临床PEDV血清样品进行检测,发现其均能与猪PEDV阳性血清发生特异性结合,而与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性血清不反应,说明本研究获得的N蛋白模拟表位可用于PEDV抗体的检测,有助于PED流行病学调查和PEDV疫苗免疫效果的评价。     

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白受体结合区(PEDV-RBD)重组蛋白的免疫原性

利用杆状病毒表达系统制备猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)纤突蛋白受体结合区(receptor binding domain, RBD)重组蛋白(PEDV-RBD),将其免疫3周龄断乳仔猪,分析其免疫原性。将PEDV-RBD P3代重组杆状病毒接种到悬浮SF9细胞中,收获后离心取上清液,将上清液超速离心浓缩重组蛋白。将仔猪分为免疫组、空载体对照组和佐剂对照组,分别用制备的重组蛋白、空载体表达产物和单纯佐剂免疫仔猪。结果显示,免疫后8周,PEDV-RBD重组蛋白组产生的特异性抗体效价达1∶12 800,中和抗体平均效价1∶284,最高达1∶512。流式细胞术分析CD3⁺CD4⁺双阳性T淋巴细胞显著高于对照组,表明重组蛋白具有良好的免疫原性,能够激发仔猪的体液免疫和细胞免疫应答。该研究为猪流行性腹泻疫苗研制提供了理论依据。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-...     

表面展示猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1的重组杆状病毒及其免疫效果研究

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白S1能够介导宿主抵御PEDV感染的中和抗体的产生,是PEDV基因工程疫苗研究的重要靶抗原。将PEDV的S1基因克隆至杆状病毒基因组中,构建包含PEDV S1基因的重组杆状病毒,使S1蛋白表面展示表达。以该重组病毒作为活载体疫苗皮下接种BALB/c小鼠,验证S1蛋白在重组杆状病毒中的表达及其免疫原性。Western blotting分析被重组杆状病毒感染的Sf9细胞中,PEDV S1蛋白能有效表达且呈现大小分别约120 k D和150 k D的2条带,其中前者至少比预期大30 k D左右,推测重组S1蛋白在Sf9细胞中被高度糖基化修饰。重组杆状病毒的胶体金免疫电子显微镜观测结果显示S1蛋白展示于杆状病毒表面;间接ELISA试验结果证明重组杆状病毒可以诱导产生PEDV特异性抗体,抗体效价达到1∶5 000。血清中和试验及淋巴细胞增殖试验结果证明,该重组杆状病毒能够激发有效的体液免疫及细胞免疫反应,S1蛋白在重组杆状病毒表面展示表达并具有免疫原性。     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

2020—2021年中国部分地区猪流行性腹泻病毒S1基因遗传变异分析

【目的】了解2020―2021年猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行情况和遗传变异情况。【方法】本研究对中国部分地区73个猪场的525份样本进行RT-PCR检测,对检测为阳性的样本进行PEDV S1基因扩增与测序,并进行流行病学统计分析,使用DNAStar软件进行核苷酸相似性分析和氨基酸位点变异分析,利用Mega 6.06软件对PEDV S1基因进行遗传进化分析,对疑似重组的序列使用RDP4软件进行S1基因重组分析。【结果】在2020—2021年的525份临床样本中PEDV检出阳性率为26.29%(138/525)。流行病学统计分析显示,冬季属于PEDV高发季节,1日龄仔猪感染率最高,为42.75%(59/183),并在中国6个地区大范围流行。S1基因遗传进化分析显示,138株PEDV S1基因序列主要位于两个分支,131株毒株属于G2群,其中126株属于G2a亚群,与HBXY2、SNJ-P在同一亚群,5株属于G2b亚群,与AJ1102、LW/L、S14在同一亚群;其余7株毒株位于G1群和G2群之间,形成一个独立分支。经重...     

猪流行性腹泻病毒 COE 抗原表位的原核表达及鉴定

为更好地了解近年来仔猪流行性腹泻疫情,收集上海地区猪流行性腹泻病猪的临床样品,扩增猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因（COE 基因）,构建原核表达载体 pColdⅡ-COE,转化至大肠埃希菌 pG-Tf2／BL21,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 结果显示,表达的 COE 蛋白大小为16 ku,Western blot 分析表明,该蛋白与临床上猪流行性腹泻病毒阳性猪的血清有特异性反应,说明所表达的 COE 蛋白具有反应原性,为进一步研制猪流行性腹泻疫苗和 ELISA 检测方法奠定了基础。     

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性

用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因（COE基因）,通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体plRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和westernblot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB／c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP—COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。