JMJD1C对牛卵丘细胞H3K9me1、H3K9me2的去甲基化作用

KDM3家族成员中KDM3A、KDM3B能够特异性去除H3K9me1与H3K9me2的甲基化修饰,而JMJD1C作为KDM3家族成员之一,与KDM3A、KDM3B即JMJD1A、JMJD1B含有相似的Jmj C结构域,但JMJD1C是否也具有对H3K9的催化作用或活性一直不明确。本研究利用RNAi方法抑制JMJD1C的mRNA表达水平,随后通过免疫荧光方法检测H3K9me1与H3K9me2的甲基化程度。结果表明,3T3-L1细胞和卵丘细胞中均存在JMJD1C的表达,并且存在H3K9me1与H3K9me2的甲基化修饰。通过siRNA对牛卵丘细胞中JMJD1C mRNA的表达进行成功抑制后,转染组JMJD1C的表达量明显下降,但免疫荧光结果显示H3K9me1、H3K9me2表达量无明显变化,即JMJD1C在mRNA水平上对去除H3K9me1与H3K9me2的甲基化修饰并无明显作用。     

水牛KDM1A/LSD1基因的克隆分析及真核表达载体的构建

本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。     

猪生长激素促分泌素受体基因真核表达载体的构建及鉴定简

本试验旨在构建猪生长激素促分泌素受体（pGHS-R）真核表达系统,并瞬时转染人源胚胎肾细胞（HEK293T）观察其表达情况。以猪基因组为模板,通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）克隆出pGHS-R的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/pGHS-R,酶切鉴定并测序,加myc标签,瞬时转染HEK293T细胞,用Western blotting鉴定该重组质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果显示,本试验成功扩增出pGHS-R编码序列,酶切和测序结果表明pcDNA3.1(+)-myc/pGHS-R构建正确,Western blotting方法证实转染的该质粒能在HEK293T细胞中正确表达目的蛋白。结果表明,本试验成功构建了pGHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。     

卵泡抑素基因过表达对其通路上相关基因表达的影响

为了探讨过表达卵泡抑素(follistatin,FST)基因对其通路上相关基因表达量的影响,本研究采用PCR方法扩增了民猪的FST基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Dsig-FST,对转染了重组质粒的成纤维细胞进行了鉴定,并采用实时荧光定量PCR检测通路上相关基因表达量的变化。结果表明,本研究成功克隆了民猪的FST基因,并在猪胎儿成纤维细胞中显著过表达,结果导致了ActRⅡB和BMP4基因显著下调 (P<0.05),Smad4和Myostatin基因有下调趋势,ActRⅡA基因有上调趋势。由此可见,FST基因的表达变化对其通路上部分相关基因的表达有不同程度的抑制或促进作用。     

水牛KDM4D基因克隆分析及其真核表达载体的构建

旨在克隆水牛组蛋白去甲基化酶KDM4D (lysine K-specific demethylase 4D)基因,对其进行生物信息学分析,并构建KDM4D基因的真核表达载体,为研究KDM4D基因在水牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎发育中的作用奠定基础。试验从水牛睾丸组织中提取总RNA,反转录cDNA后, RT-PCR技术克隆KDM4D基因片段,并运用生物信息学软件对序列进行分析;随后将KDM4D基因片段连接至真核表达载体pEGFP-C1,再把重组质粒转染进HEK293T细胞。结果表明,克隆所得的水牛KDM4D基因片段编码区全长1 155 bp,共编码384个氨基酸。水牛KDM4D基因与黄牛、山羊、绵羊、犬、猫、猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为98.4%,96.6%,96.3%,84.9%,84.1%,81.4%,80.4%,77.4%,77.3%。多重比较和进化树分析结果显示,KDM4D基因在不同物种及生物进化中具有较高的保守性。蛋白结构域分析显示,克隆所得的KDM4D蛋白结构特殊,只具有1个JmjN (Jumonji N)和1个JmjC (jumonji C)结构域,与KDM4家族其他成员相比缺少PHD (plant homeodomain)和Tud (tudor)功能域。KDM4D蛋白质三级结构预测结果显示,水牛、黄牛和人3种物种间具有较高的相似性。转染结果显示,构建的重组质粒可以在HEK293T细胞中表达。本试验成功克隆水牛KDM4D基因,对其进行生物信息学分析,构建了真核表达载体pEGFP-C1-KDM4D,并在HEK293T细胞中成功表达。     

HA基因真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

目的：为后续进一步研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响提供技术支撑。方法：应用PCR方法体外扩增血凝素(HA)基因全序列,并利用pcDNA3.1(+)载体构建甲型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)的真核表达质粒(pcDNA3.1 (+)-HA),经双酶切鉴定后,转染293T细胞,通过RT-PCR和Western blot方法观察该重组质粒在293T细胞中的表达情况。结果表明,pcDNA3.1 (+)-HA重组质粒构建成功;与空白及阴性对照相比,转染293T细胞48 h后的HA mRNA水平显著上升(2.4×10³,P<0.000 1),并能在293T细胞中成功表达,为深入研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响奠定了基础。     

细胞松弛素B对猪孤雌囊胚DNA甲基化和组蛋白乙酰化的影响

以猪电激活孤雌胚胎为研究对象,通过添加细胞松弛素B(CB)对胚胎发育过程中DNA甲基化和组蛋白乙酰化的变化进行了研究。利用荧光定量PCR检测了囊胚中DNA甲基转移酶(Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b)、组蛋白乙酰转移酶(Hat1)、组蛋白去乙酰化酶(Hdac1)以及凋亡相关基因(Bax,Casp3)mRNA水平的表达,并通过免疫荧光染色检测了囊胚中5hmc/5mc,AcH3K9,H3K9me3的表达水平。结果显示:5mg/L CB处理4h能够显著提高猪孤雌囊胚的卵裂率和囊胚率(P0.05),减少囊胚细胞凋亡数量;DNA甲基转移酶(Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b)、组蛋白乙酰转移酶(Hat1)、组蛋白去乙酰化酶(Hdac1)以及凋亡相关基因(Bax,Casp3)mRNA水平均明显下降;AcH3K9的表达无明显变化;而5hmc/5mc和H3K9me3的表达明显升高。该结果为进一步研究猪胚胎发育过程中的表观遗传变化提供了试验依据。     

JARID2对牛卵丘细胞H3K9me3、H3K27me3的甲基化修饰作用

本试验利用RNAi方法抑制牛卵丘细胞中JARID2基因mRNA的表达水平,通过免疫荧光方法检测H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3的甲基化程度。结果表明,在牛卵丘细胞中存在JARID2的表达,并且存在H3K9me3、H3K27me3的甲基化修饰,但没有检测到H3K4me3、H3K36me3的甲基化修饰。通过siRNA对牛卵丘细胞中JARID2 mRNA的表达进行成功抑制后,转染组JARID2的表达量明显下降,但H3K4me3、H3K27me3表达量无明显变化,而H3K9me3、H3K27me3表达量明显下降,即JARID2在mRNA水平上能够影响H3K9me3、H3K27me3的甲基化修饰程度,而对H3K4me3、H3K36me3的甲基化修饰无明显作用。     

鸡β-防御素-1对鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用

本文旨在研究鸡β-防御素-1(AvBD1)对鸡IBDVVP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用。通过基因工程技术,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2。14日龄岭南黄肉鸡随机分成5组,分别免疫PBS、空质粒载体pcDNA3.1(+)、重组质粒pcDNA3.1(+)-VP2、重组质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcD-NA3.1(+)-VP2联合免疫、IBD弱毒苗。收集免疫后不同时期的外周血血清样本,用ELISA方法检测血清中IB-DV VP2特异性抗体水平,通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量。结果表明,联合免疫组(即pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2共同免疫)VP2特异性抗体水平显著高于其他组;单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组VP2特异性抗体水平与免疫IBD弱毒苗组相当,显著高于PBS组与空质粒载体pcD-NA3.1(+)组。在二免后第7天,联合免疫组外周血中CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量也显著高于单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组,其它时间无显著性差异。IBDV攻毒...     

质粒载体表达抑制猪瘟病毒shRNA在猪胚胎成纤维细胞上的复制

以质粒pSilencer3.1Hygro为基础,构建了针对猪瘟病毒Npro基因和NS4A基因mRNA的siRNA双表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞后,在潮霉素B的筛选压力下,获得5株稳定整合shRNA表达盒的猪胚胎成纤维细胞克隆.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72 h后对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的5株细胞克隆中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖明显降低,表明所构建siRNA双表达载体转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.本试验为研究猪瘟病毒的防治和通过RNAi建立猪的抗病育种提供了新的方法.     

鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体及突变型的构建及信号通路初探

试验旨在构建鸡、鸭、鹅黑素皮质素受体5(Melanocortin Receptor-5,MC5R)及其突变体的真核表达载体,并比较野生型与突变体MC5R在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达及功能的差异。从三种家禽血液中分别提取全基因组DNA,以其为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。用同源重组方法将扩增的目的基因片段定向插入表达载体pcDNA3.1(+)中。单点突变构建pcDNA3.1(+)-MC5Rs突变型。用脂质体法将三种禽类野生型和突变型重组质粒pcDNA3.1(+)-MC5Rs分别瞬时转染入HEK293T细胞中,用双萤光素酶报告基因法检测胞内第二信使cAMP水平的变化来反应受体的表达和激活情况。结果表明:成功构建了鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体与各3个突变型(D119A、F254A和H257A)。在HEK293T细胞中表达时,与野生型相比,F254A的基础活性大幅升高,D119A与H257A的基础活性变化不大;D119A与H257A对激动剂α-MSH的反应活性完全丧失,F254A对于激动剂α-MSH的反应活性降低,为进一步研究体外鸡、鸭、鹅MC5R功能奠定基础。     

四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcDNA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-P_Tight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-P_Tight-MC4R真核表达载体, 并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。     

MG132对水牛卵母细胞成熟及IVF胚胎发育的影响

为了研究蛋白酶体抑制剂三肽基乙醛(MG132)对水牛卵母细胞体外成熟及体外受精(IVF)胚胎发育的影响,试验采用不同浓度(0,1,2.5,5μmol/L)MG132成熟液培养水牛卵母细胞24 h并统计第一极体排出率;然后对各组卵母细胞进行IVF,统计胚胎的发育率;最后采用免疫荧光技术检测组蛋白甲基化修饰(H3K4me3、H3K9me2和H3K9me3)的表达情况。结果表明:卵母细胞经不同浓度MG132处理后,其第一极体的排出率以及后续IVF胚胎的分裂率、8-细胞率差异不显著(P0.05)。但1μmol/L MG132提高了IVF胚胎的桑椹胚率和囊胚率(P0.05);而5μmol/L MG132对胚胎的桑椹胚率和囊胚率无显著促进作用(P0.05)。1,5μmol/L MG132分别提高胚胎的H3K4me3、H3K9me2的表达(P0.05),但各组H3K9me3的表达无显著差异(P0.05)。说明1μmol/L MG132通过提高胚胎H3K4me3的表达从而促进IVF胚胎的发育。     

猪趋化因子CXCL12及其受体CXCR4真核表达载体的构建

采用RT-PCR的方法从猪脾脏组织中扩增猪CXCL12、CXCR4基因的cDNA,对编码区核苷酸序列分析后,将扩增产物经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后再克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5HisA,构建了pcDNA3.1-CXCL12和pcDNA3.1 -CXCR4重组质粒,经酶切及测序鉴定后,进行核苷酸同源性分析.结果表明RT-PCR分别获得获得长度为386bp、1019bp的阳性产物,酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-CXCL12和pcDNA3.1-CXCR4构建成功,为进一步研究猪CXCL12、CXCR4基因的功能奠定基础.     

SAHA处理对猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响

为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对德保猪手工克隆胚胎(HMC)发育潜能的影响,试验摸索SAHA的适宜处理浓度[0(对照),1.0,2.5,5.0,7.5,10.0μmol/L]和时间(0,6,12,24 h);之后分为4组,SAHA组、体外受精(IVF)组、孤雌激活(PA)组、对照(HMCC)组,分别在体外发育的1细胞期、2细胞期、4细胞期、囊胚期收集胚胎,在相同时期下比较各组胚胎组蛋白H4K8乙酰化(Ac H4K8)水平差异和相关基因(HDAC1、HAT1、ASF1A、OCT-4)相对表达量。结果表明:7.5μmol/L SAHA处理囊胚率显著高于对照(P0.05),12 h囊胚率显著高于0 h(P0.05);所以适宜处理浓度为7.5μmol/L,适宜处理时间为12 h。在1细胞期、2细胞期、囊胚期,SAHA组Ac H4K8水平接近IVF组水平(P0.05)。在囊胚期,SAHA组HDAC1基因相对表达量接近IVF组(P0.05);在囊胚期,SAHA组OCT-4基因相对表达量接近IVF组(P0.05)。说明SAHA可以使HMC胚胎Ac H4K8水平接近IVF水平,并纠正克隆胚胎乙酰化的异常,从而提高克隆胚胎发育潜能。     

小鼠MyoD基因真核表达载体的构建与检测

为了最终建立诱导小鼠iP S细胞为成肌细胞的方法,试验在克隆小鼠Myo D基因的基础上,将其与pc DNA3.1载体连接,以构建真核表达载体;采用脂质体法将重组质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,利用Real-time PCR技术、免疫荧光检测和流式分析等技术对转染前后细胞的Myo D基因表达情况进行检测。结果表明:成功克隆获得Myo D基因,并构建真核表达载体Myo D-pc DNA3.1;转染Myo D-pc DNA3.1的小鼠胚胎成纤维细胞经免疫荧光检测后在荧光显微镜下呈现表达Myo D基因的红色;Real-time PCR检测其Myo D基因相对表达量提高至8.926±0.010;经BD Accuri-C6个人型流式细胞仪检测,约有93%的转染细胞表达Myo D蛋白,在荧光倒置显微镜下可观察到表达Myo D蛋白而呈现的绿色荧光。说明已成功构建特异表达Myo D基因的真核表达载体Myo D-pc DNA3.1。     

真核表达质粒pcDNA.3.1(+)-ACE2的构建及其在CHO细胞中的表达

为了构建pcDNA.3.1(+)-血管紧张素转化酶2(ACE2)真核表达质粒并检测在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达,从羊肾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增出ACE2基因,后将其与pcDNA3.1载体进行连接重组,构建pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,经HindⅢ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切及DNA序列测序分析等方法验证后,通过Lipofectamine 3000脂质体介导转染至CHO细胞,Western blot法检验ACE2基因在蛋白质水平上的表达。结果显示:RT-PCR扩增出大小约为2 200 bp特异ACE2基因片段,连接获得的pcDNA3.1(+)-ACE2重组体经HindⅢ、XhoⅠ酶切后分别出现约2 200 bp和5 000 bp片段,测序分析与Gen Bank上公布的结果完全一致,表明成功克隆了重组pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,Western blot检测显示该pcDNA3.1(+)-ACE2能在CHO细胞中表达。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,并证实其能在CHO中表达,为后续探究ACE2蛋白活性及其作用的研究奠定了基础。     

贵州白香猪γ-干扰素真核表达质粒的构建

为了构建贵州白香猪γ-干扰素真核表达载体,试验以已构建的含有γ-干扰素基因的pMD-GZ-IFN-γ质粒为模版,利用特异性引物进行PCR扩增,得到大小为501 bp的γ-干扰素基因的开放阅读框,将所得IFN-γ基因克隆至经相同双酶切处理后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ。测序结果表明:克隆至pcDNA3.1(+)的基因序列为γ-干扰素序列,说明γ-干扰素基因真核表达载体构建成功。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒(JEV)NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1(+)免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1(+)空载体免疫组差异极显著(P0.01);pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

牛副流感病毒3型核衣壳蛋白基因的真核表达

根据牛副流感病毒3型(BPIV-3)内蒙09株(NM09)全基因组序列(GenBank登录号:JQ063064)设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出牛副流感病毒3型分离株的核衣壳蛋白(N)基因,通过NheI和NotI限制性内切酶位点亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+),获得真核重组质粒pcDNA3.1-N。采用Superfect转染试剂将重组质粒转染至BSR细胞中,转染后的BSR细胞经间接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测,重组质粒pcDNA3.1-N在BSR细胞中能正确表达N蛋白。本研究结果为BPIV-3新型疫苗的研制奠定基础。