sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下沙门菌的转录组分析

为探明沙门菌(Salmonella)在sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下转录组变化情况。本试验采用HiSeq测序平台对沙门菌LT2菌株及其Hfq敲除株进行高通量测序,通过DESeq2差异分析方法筛选敲除sRNA伴侣蛋白Hfq条件下的差异表达基因,对其进行生物信息学GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。结果显示,对照组和试验组分别得到12 753 534条、8 254 308条Clean Reads。通过DESeq2差异分析获得差异基因1 055个,其中表达上调基因516个,表达下调基因539个。GO功能显著性富集分析表明显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、碳水化合物代谢过程等生物过程中。Pathway显著性富集分析表明显著差异表达基因富集到细菌趋化性、丙酸代谢和碳代谢等11个信号通路中。结果表明,本试验应用RNA-seq技术丰富了sRNA伴侣蛋白Hfq调控基因数量,筛选出20个受伴侣蛋白Hfq调控的显著差异表达基因,其中4个基因功能及编码蛋白未知,注释了差异表达基因的生物学功能及信号通路,推断Hfq在细菌对数期主要通过影响营养提供和趋化性等途径,继而影响细菌的正常生理活动,为Hfq协同sRNA的调控机理研究及sRNA靶基因的筛选奠定了基础。     

伴侣蛋白Hfq对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究小RNA(sRNA)伴侣蛋白Hfq在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染致病过程中的作用,本研究采用Red同源重组法构建了禽致病性大肠杆菌FY26的hfq缺失株FY26Δhfq,通过测定缺失株生长曲线、生物被膜形成、体内定殖、胞内存活等能力来判定sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC致病力的影响。在体外,生物被膜形成能力直接决定着细菌对外界环境的抵抗能力,而在细菌进入体内后,其生长速率、黏附、定殖、吞噬细胞内的存活等能力均会直接影响其致病力。在进行了缺失株FY26Δhfq与野生株FY26的生长曲线测定试验、生物被膜形成能力测定试验、感染雏鸡试验、雏鸡体内定殖与侵袭试验、DF-1细胞黏附及HD11吞噬细胞内存活试验后,结果表明：hfq缺失株相较野生株其生长速率下降,生物背膜形成能力降低了18.6%,感染雏鸡时毒力降低,感染7 d后存活率为80%,在雏鸡体内定殖侵袭减弱,体内竞争能力下降至33.2%,对DF-1细胞的黏附能力降低,HD11吞噬细胞内的存活能力下降,单个细胞内存活的细菌数大多少于6个。研究表明,sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC的致病力起着关键的正向调控作用。     

atpA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响

为研究编码ATP合酶α亚基对大肠杆菌生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1 (WT) atpA基因缺失菌株LCE-1ΔatpA (KO)和基因回补株LCE-1ΔatpA/pBR322-atpA (RS),并均采用PCR和测序鉴定。在此基础上,进一步分析atpA基因缺失对大肠杆菌的生长特性、生化特性的影响,结果显示,在LB培养基中KO菌株与WT菌株相比生长无明显差异,但在M9培养基中生长明显减缓;KO菌株的部分生化特性也发生了变化,对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变,α-葡萄糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生了改变。通过试管及微量结晶紫法分析3株菌生物被膜(BF)的形成能力,结果显示atp基因缺失能够显著降低大肠杆菌BF的形成能力(P<0.01)。对这3株菌进行酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激测定这3种菌株对环境变化的应激能力,结果显示atp基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定,结果显示KO菌株对多种抗生素的敏感性有所增强。利用KO、WT菌株分别感染...     

鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株的构建及生物学特性分析

利用λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株,并检测其生长特性、运动性、生物被膜形成能力、胞内存活能力及LD₅₀毒力。结果显示,与野生型菌株相比,oppCDF基因缺失株的生长特性无明显变化;oppCDF基因缺失株可降低鼠伤寒沙门菌的运动性;oppC与oppF基因缺失后可提高鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力;同时,oppC基因缺失可降低在RAW267.4细胞内的存活能力和其在小鼠体内的毒力,oppF基因缺失可显著增强在RAW267.4内的存活能力和对小鼠毒力的影响,而oppD基因缺失后其在小鼠体内的毒力和RAW267.4内的存活率均无显著变化。研究表明,oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌的运动性、生物被膜形成和毒力密切相关,为进一步揭示鼠伤寒沙门菌致病作用中的复杂调控和机制提供了理论基础。     

肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为探究肠炎沙门菌伴侣蛋白Hfq对nmpC的调控机理及其基因编码产物OmpD在致病过程中参与的生物学功能,采用PCR方法扩增肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD基因nmpC,并将其克隆至原核表达载体pColdTM TF,构建重组表达载体pColdTM TF-nmpC.将其转化受体菌E.coli BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白OmpD.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得鼠源抗OmpD抗体.结果显示,经酶切、测序和Western blot鉴定分析,本研究成功构建并表达肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD,经纯化后免疫BALB/c小鼠,获得特异性的鼠源OmpD多克隆抗体,为进一步探究肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD在致病过程中参与的生物学功能奠定基础.     

沙门氏菌对鱼类的致病作用及治疗试验观察

用沙门氏菌50115号菌对银鲫(Caiassius auratus gibelio)及小白鼠(km)攻毒(7.5×108个菌感染)成功,而且鱼对该菌比小白鼠更敏感,症状更突出;银鲫的24 h LD50为3×107个/mL;抑菌实验结果表明红霉素、痢特灵、庆大霉素、二氯异氰尿酸钠对该菌有抑制作用;把二氯异氰尿酸钠、痢特灵、红霉素,三种药物按0.4 mg/kg、1 mg/kg、0.4 mg/kg三种剂量对病鱼进行药浴,并结合投喂相应药饵,治愈率分别为60%、100%、80%.     

鸡肠炎沙门氏菌外膜蛋白F的原核表达及免疫原性分析

根据GenBank中收录的鸡肠炎沙门氏菌OmpF基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌辽宁分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌OmpF基因,用IEDB Analysis Resource在线预测分析,该基因可能存在15个线性B细胞抗原表位;同时将该基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-OmpF,转入大肠杆菌BL21中,获得OmpF重组蛋白。Western-blot检测结果表明,该重组蛋白的分子质量约为66 kD(含标签蛋白),能被鸡沙门氏菌阳性血清识别,初步证实该蛋白具有免疫原性,为鸡肠炎沙门氏菌亚单位疫苗的进一步研究和开发奠定了理论基础。     

鸡白痢沙门氏菌IPAJ蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法的建立

【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1∶25 600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为：抗原包被浓度为5μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250...     

表达RGD和MEL重组沙门氏菌的构建及其对B16细胞凋亡作用的研究

为研究融合表达肿瘤靶向肽(RGD)和蜂毒肽(MEL)双基因重组减毒沙门氏菌对小鼠黑色素瘤B16细胞的体外抑瘤作用,本实验将RGD-MEL基因片段克隆至pEGFP-N1载体,将重组载体导入减毒沙门氏菌LH430,构建了重组沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL,经PCR技术、质粒双酶切鉴定后采用阳性重组菌株侵染体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞,提取细胞总RNA经反转录后采用PCR检测目的基因RGD-MEL转录情况,western blot检测目的蛋白RGD-MEL以及凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax的表达;流式细胞术检测B16细胞凋亡情况。结果显示:导入RGD-MEL基因的减毒沙门氏菌LH430侵染B16细胞后,目的基因RGD-MEL高效表达;经重组菌株侵染的B16细胞凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax表达水平均显著增高(p<0.05);重组沙门氏菌诱导B16细胞的凋亡作用较PBS组显著增强(p<0.05)。本研究为细胞穿膜肽和细菌联合治疗肿瘤提供实验支持,并为后续动物试验奠定了研究基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建及动物免疫试验

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株.PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5.将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5).鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测.结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体.本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础.     

大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望

大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统.但由于大肠杆菌表达系统所表达的蛋白常常形成无活性的包涵体,为此研究者摸索出许多用来提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法,近年来在提高重组蛋白可溶性表达的策略方面取得了一定进展,现介绍如下.     

HPLC法同时测定莲黄颗粒中4种有效成分及莲黄颗粒对沙门氏菌的抗菌作用研究

试验旨在建立HPLC法测定莲黄颗粒中有效成分含量的方法,同时研究莲黄颗粒对沙门氏菌的体内外作用效果。采用e2695高效液相系统测定莲黄颗粒中4种有效成分;采用打孔法和鸡沙门氏菌感染模型法研究莲黄颗粒体内外对沙门氏菌的作用效果。结果显示,莲黄颗粒中没食子酸、秦皮甲素、黄芩苷、穿心莲内酯4种成分在测定的质量浓度范围内线性关系良好,R2均大于0.999,回收率在97%～103%之间,RSD值均小于2.5%。建立的HPLC检测方法简单、高效、灵敏度好。莲黄颗粒体外对沙门氏菌的抑制为高敏,体内能改善沙门氏菌感染导致鸡采食量的降低,并能修复肝脏和盲肠的损伤。研究为莲黄颗粒质量评价和临床应用提供数据支持。     

Bm59基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制、转录及组装的影响

Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。     

表达幽门螺杆菌外膜蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗菌对小鼠的免疫保护作用

为研究含pLAO的重组耻垢分枝杆菌疫苗(Recombinant Mycobacterium smegmatis,rM.S)对小鼠的保护作用。将重组耻垢分枝杆菌疫苗pLAO(MS)2×107灌胃免疫接种BALB/c小鼠,同时设PBS组、耻垢分枝杆菌空菌组,免疫4周后,各组处死一批小鼠,取胃组织待用;余下的小鼠用幽门螺杆菌标准株(Helicobacter pylori SS1,Hp SS1)攻击2次,4周后处死小鼠,进行胃组织快速尿素酶试验、Hp培养、炎症程度及其炎症活动度评分,以评价疫苗对胃黏膜Hp感染的免疫保护作用,ELISA检测Hp特异性血清IgG和IgA水平。结果表明疫苗组Hp定植评分均明显低于PBS组和空菌组,疫苗组不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示rM.S疫苗诱导的Hp特异性血清IgG、IgA水平都升高。因此rM.S疫苗经灌胃接种BLAB/c小鼠能降低Hp定植,减轻胃黏膜的炎症反应,对Hp感染有明显的预防保护作用。     

兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果

用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因,通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV—Bac—VP60,经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定,结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下,用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔,结果显示,免疫后21天,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价为2^6～2^7,该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击,本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

绵羊c-Myc与EGFP融合蛋白的真核表达及其对细胞增殖的调控作用

为了探讨c-Myc基因对细胞增殖及相关基因表达的调控作用,本试验构建了c-Myc-（G₄S）₃-EGFP融合基因的真核表达载体pc-Myc-EGFP,并利用生物信息学分析了其结构和理化特征。转染后分别通过细胞计数和qRT-PCR检测了其对绵羊胚胎成纤维细胞（sheep embryonic fibroblasts,SEF）增殖及相关基因表达的影响,并利用启动子分析软件解析了相应的表达调控机制。酶切鉴定和测序结果表明,载体构建成功。生物信息学分析表明,绵羊c-Myc蛋白主要定位于细胞核,含有螺旋环螺旋（helix-loop-helix,HLH）结构域,其分子量为48 474.78 u。融合蛋白c-Myc-（G₄S）₃-EGFP有较强的亲水性,且含有31个磷酸化位点。因（G₄S）₃有较高的灵活度（9.848 5）,两侧的c-Myc和EGFP都保持各自的空间构象且互不干扰。进一步的细胞试验结果表明,重组质粒pc-Myc-EGFP在SEF中能够表达。过表达c-Myc促进了SEF的增殖,使cyclin D2、Cdk4、Cdk6、cyclin E1、cyclin A2、cdc25A mRNA的表达水平分别升高至5.20、3.10、6.54、6.52、23.37和8.22倍（P<0.01）,E2F1 mRNA的表达升高至1.83倍（P<0.05）。启动子分析结果表明,各基因的5'调控区存在c-Myc和E2F1的结合元件。综上所述,绵羊c-Myc通过上调细胞周期相关基因的表达促进SEF细胞增殖,c-Myc的作用机制可能是通过直接作用于靶基因5'调控区的E-box元件,也可能是通过其他转录因子（如E2F1）的间接调控作用而实现。     

有氧运动对兔骨关节炎软骨细胞凋亡及相关基因蛋白表达的影响

探讨有氧运动对兔骨关节炎软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达的影响。建立兔骨关节炎(OA)模型,试验分为空白对照组、模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组。TUNEL标记法检测不同强度有氧运动对关节炎软骨细胞凋亡的影响;Western blot检测Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达。模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率均显著高于空白对照组,低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率均显著低于模型对照组,中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率显著低于低强度运动组(P0.01);模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著高于空白对照组,Bax蛋白表达显著低于空白对照组;低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著低于模型组对照组,Bax蛋白表达显著高于模型对照组;中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著低于低强度运动组,Bax蛋白表达显著高于低强度运动组(P0.01)。不同强度有氧通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达降低关节炎软骨细胞凋亡,并下调MMP-2、MMP-13,降低软骨细胞的损伤,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建及表达

根据PCV2Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因（702bp）。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体（pAdeasy-1）共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过免疫荧光、PCR和Westernblot检测证明PCV2Cap蛋白基因在293细胞内获得表达。     

猪戊型肝炎病毒tORF2蛋白的基因克隆表达及免疫原性测定

戊型肝炎(hepatitis E)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的以黄疸为主的急性病毒性肝炎。该病主要经粪-口途径传播,在非人灵长类动物、啮齿类动物、猪、牛、羊、鸡等其他动物中广泛分布和传播,是一种人畜共患病。因此,该病已经成为预防医学和公共卫生学领域研究的热点之一,受到广泛关注。该病临床表现为发热、食欲不振、恶心、呕吐、尿色深黄、常见黄疸,病程可持续1周,但具有自限性。该病主要侵害青壮年,常表现为爆发性肝炎,孕妇感染后死亡率可达20%,广泛流行于亚     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin 6的原核表达及对酚氧化酶原活性和抗菌肽表达的调控作用

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)对昆虫的免疫反应起重要调节作用。根据家蚕基因组数据库序列设计引物,从家蚕幼虫血细胞中克隆了Bmserpin6的编码基因,并构建重组表达载体,在大肠杆菌中成功表达了重组Bmserpin6蛋白。将纯化的重组Bmserpin6注射家蚕5龄幼虫后6 h提取家蚕血液制备血清,检测血清样品中的酚氧化酶原活性显著下降(P0.05)。体腔注射重组Bmserpin6后的家蚕5龄幼虫再通过微球菌诱导蚕体内抗菌肽gloverin2基因的表达,结果显示幼虫脂肪体和血细胞中的gloverin2基因表达显著下调(P0.05)。依据上述结果推测:体外表达的重组Bmserpin6可以调节蚕体内2个重要的免疫途径,即抑制蚕体酚氧化酶原的激活和外源细菌诱导的蚕体抗菌肽的产生。