奶牛子宫内膜炎化脓隐秘杆菌的分离与PCR鉴定

对内蒙古呼和浩特地区奶牛子宫内膜炎化脓隐秘杆菌进行了分离与鉴定。对初步分离疑似的化脓隐秘杆菌采用API Coryne鉴定系统进行生化鉴定,并利用PCR技术扩增其溶血素plo基因。共分离到化脓隐秘杆菌32株,分离率为23.5%;通过扩增化脓隐秘杆菌的特异性plo基因进一步鉴定分离菌。     

化脓隐秘杆菌的研究进展

化脓隐秘杆菌是引起家畜乳房炎、子宫内膜炎、肺炎等感染的重要病原菌之一,给养殖业带来了较大的损失。在我国,90%以上的奶牛子宫内膜炎是由病原微生物引起的,经鉴定其中23.5%微生物是化脓隐秘杆菌,因此,深入地研究和探索化脓隐秘杆菌不仅对有效防治奶牛子宫内膜炎具有指导意义,而且对控制病原菌的传播提供重要的理论依据。     

猪化脓隐秘杆菌的分离及鉴定

化脓隐秘杆菌根据16SrRNA基因序列分析结果,将其归入隐秘杆菌属,主要存在动物的黏膜上,是一种条件致病菌,可引起各种非特异性化脓性感染,部分临床症状与副猪嗜血杆菌相似;一起疑似副猪的检测过程中分离到一株优势菌株,经形态学、生化、16SrRNA鉴定、同源性比对和临床症状确定为化脓隐秘杆菌;药敏试验结果为病原菌对头孢噻呋钠、杆菌肽、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、恩诺沙星高度敏感,对所选其余药物不敏感。     

产后健康和子宫炎奶牛子宫中化脓隐秘杆菌分离鉴定

为了调查产后3周内健康和子宫炎奶牛子宫中细菌分离情况,尤其是化脓隐秘杆菌及其毒力基因的分布情况。本试验采集了产后3周内15头健康奶牛和11头患子宫炎奶牛的子宫分泌物进行细菌分离鉴定,并对分离到的化脓隐秘杆菌进行毒力基因的检测。结果表明,大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、芽孢杆菌是产后3周内子宫分泌物最常分离培养的细菌;从15头健康奶牛和11头患病奶牛的子宫分泌物中分离到17株化脓隐秘杆菌,所有菌株均携带plo基因和fimA基因;携带多种毒力基因的化脓隐秘杆菌在健康和子宫炎奶牛中均可以分离到。本试验为进一步研究化脓隐秘杆菌对子宫内膜的致病机理提供参考依据。     

奶牛源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

本研究旨在分离鉴定来自北京某奶牛场死亡奶牛肺脏的1株疑似病原菌CVCC 3982,并测定其致病性。通过分离培养获得疑似病原菌,采用Biolog鉴定系统和16S rDNA序列分析对其进行了鉴定,人工接种CD-1小鼠测定了其致病性,合成引物对其主要毒力基因进行了检测。结果显示,该疑似病原菌为革兰氏阳性杆菌,β溶血,Biolog鉴定结果显示其为化脓隐秘杆菌,其16S rDNA序列与化脓隐秘杆菌模式菌株NCTC 5224的同源性达100%,系统发育分析显示其与化脓隐秘杆菌处于同一分支。腹腔注射该菌可致小鼠死亡。分离菌株基因组中含有溶血素(PLO)基因,神经氨酸酶H(NanH)基因,神经氨酸酶P(NanP)基因,菌毛基因(fimA、fimC和fimE),但缺失胶原结合蛋白(CbpA)基因和菌毛fimG基因。结果表明该分离菌株为化脓隐秘杆菌且具有致病性。     

猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定

从一例肝、肺化脓性结节,脾出血性肿大的病猪体内分离到一株革兰氏阳性、细长、形态不规则的杆菌,该菌在TSA平板、普通绵羊血琼脂、巧克力平板上生长缓慢,在普通绵羊血琼脂上呈α-溶血。对该菌的16S rDNA进行PCR扩增、测序、比较,结果显示该菌与化脓隐秘杆菌的16S rDNA有99%的同源性,进一步用API生化鉴定,结果也与其相符。该菌在24~52 h内100%致死小白鼠,腹腔接种新西兰兔,接种兔72 h内死亡,表明该菌为致病性细菌。     

山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定与分析

通过对重庆某羊场送检病死羊只进行病原菌的分离培养、形态学鉴定、生化鉴定、药敏试验、致病性试验及16S r RNA序列分析。结果从病变组织中分离到1株革兰阳性短棒状杆菌,其对多种抗生素敏感,能够引起小鼠肝脏和肺脏发生病变,PCR扩增出长为1 434 bp的目的序列,已被Gen Bank数据库收录,序列号为KJ842125,将该序列与NCBI中公布的序列进行比对,发现所得序列与化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,登陆编号为HQ712123)同源性高达98%,将该序列与其相关性较高菌株的16S r RNA构建系统发育进化树,与化脓隐秘杆菌聚为一簇。本研究为化脓隐秘杆菌致病机理、诊断技术和疾病控制奠定了基础。     

犊牛化脓隐秘杆菌性肺炎的病原鉴定

2007年11月,黑龙江省某农场肉牛爆发传染病,以犊牛化脓性肺炎为特征,平均发病率达58%,死亡及淘汰率达9.3%。从病死牛内脏器官分离到一种具有多形性的革兰氏阳性杆菌,把分离的菌株接种小白鼠证明具有较强的致病性,经生物学特性鉴定,以及应用PCR方法获得16S rRNA基因并进行克隆测序分析,结果证明分离的细菌是化脓隐秘杆菌。药敏试验结果表明该细菌对阿奇霉素、红霉素和四环素等药物高度敏感,应用敏感药物通过气管内注射的方式使疫情得到有效控制。     

一株猪源化脓隐秘杆菌的分离与鉴定

四川内江某猪场发生疾病,病猪的肝、肺出现化脓性结节,脾出血性肿大,无菌采集病猪的病变组织进行细菌分离,得到1株革兰氏阳性菌,形态多样,呈球状、杆状或棒状,单在或成丛排列,该菌在TSA平板上生长缓慢。经细菌分离培养、16S rDNA鉴定、动物致病性试验等,结果显示该株分离菌为致病性化脓隐秘杆菌。药敏试验显示,该分离菌对头孢呋肟、氨苄西林、卡那霉素、四环素、氟苯尼考等药物有不同程度的敏感性,对于指导临床用药具有积极的意义。     

牛源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其PCR检测方法的建立

摘要:为分离鉴定牛源化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)并建立其PCR检测方法,本研究从某规模化奶牛场患牛肺组织中分离出两株细菌,根据其形态特征、培养特性及生化特性,结合16S rRNA分析确定分离茵为A.pyogenes.对小鼠致病性试验显示纯培养物对小鼠致死率较高,药敏试验表明分离茵仅对少数种类抗生素如头孢唑啉、氧氟沙星、阿奇霉素等敏感.本研究同时建立了快速检测A.pyogenes溶血素(PLO)基因的PCR方法,敏感性试验显示最低检出菌数为9.2×103 cfu/mL,特异性试验表明与其他细菌如布鲁氏茵、大肠杆菌等无交叉反应,通过对已知临床样本检测评估显示该方法适用于临床感染样品的检测.     

山羊化脓隐秘杆菌分离鉴定及其神经氨酸酶遗传进化分析

为确诊重庆涪陵地区一山羊养殖场发生山羊皮下脓肿的病原,采集病料分离病原、进行药敏试验。通过生化试验和16S rRNA分子方法鉴定病原菌;PCR扩增分离株的神经氨酸酶基因(neuraminidase,NA),并利用细菌神经氨酸酶的隐马尔科夫模型(Pfam编号为PF13088)搜索自建的本地蛋白质组数据库,通过MEGA7.0构建系统进化树,从而分析神经氨酸酶基因在脊椎动物、寄生虫、真菌、细菌和病毒中的遗传进化特征,并利用PredictProtein进行分离株神经氨酸酶的点突变分析。结果表明,分离株的16S rRNA基因与JQ975932.1(中国新疆)株化脓隐秘杆菌序列同源性高达99.7%,结合生化特性确诊分离株为化脓隐秘杆菌;利用模型进行检索,共检索到214条神经氨酸酶氨基酸序列。神经氨酸酶遗传系统进化树显示,细菌神经氨酸酶主要集中在放线菌门中,脊椎动物的神经氨酸酶主要聚集在GroupⅠ和GroupⅡ,寄生虫的神经氨酸酶主要集中于GroupⅠ,真菌神经氨酸酶分布较广,存在GroupⅠ、GroupⅡ以及GroupⅣ中,而病毒神经氨酸酶主要分布于GroupⅠ和GroupⅡ。点突变分析表明,细菌神经氨酸酶不同位点的氨基酸突变对神经氨酸酶功能的影响不同。     

牛源金黄色葡萄球菌16SrRNA分子鉴定与随机多态性扩增分型

利用16S rRNA保守序列对引起内蒙古地区奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,并且建立引物随机多态性扩增(RAPD)体系对金黄色葡萄球菌分离株进行基因分型研究.结果表明,共分离出金黄色葡萄球菌35株,RAPD结果显示这35株菌均可得到清晰的RAPD指纹图谱,扩增产物在1～8条带之间,产物大小在350～4 500bp之间.菌株分为6个基因型,Ⅳ型为该地区的流行优势菌群.不同牛场各基因型菌株分布有明显差异,这与牛场的环境和病原菌在牛场间流行传播情况有关.研究结果为地区性奶牛乳房炎的防治及新疫苗的研制提供了可靠的理论依据.     

Molecular identification of Arcanobacterium bialowiezense and Arcanobacterium bonasi based on 16S-23S rRNA intergenic spacer region sequences

In the present study, the 16S-23S rDNA intergenic spacer region (ISR) of Arcanobacterium (A.) bialowiezense DSM 17162, A. bonasi DSM 17163, A. bernardiae DSM 9152, A. haemolyticum DSM 20595, A. hippocoleae DSM 15539, A. phocae DSM 10002, A. pluranimalium DSM 13483 and A. pyogenes DSM 20630 was amplified, sequenced and compared with the corresponding 16S rRNA gene sequences yielding comparable phylogenetic relationships. The ISR sequence of A. bialowiezense and A. bonasi allowed the design of species-specific oligonucleotide primers which could successfully be used for PCR-mediated identification of previously characterized A. bialowiezense and A. bonasi isolated from infections of the European bison. The presented molecular identification might help to improve a future diagnosis of both newly described bacterial pathogens.     

不同猪源副猪嗜血杆菌河南分离株16S rRNA基因的遗传进化分析

为研究来自河南省不同猪源的副猪嗜血杆菌(Hps)的遗传演化关系,应用PCR方法扩增所分离的良种猪源、家养野猪源和地方土猪源等3株Hps(KF0901、JZ0801和XY0501)的16S r RNA基因,并进行序列比较分析。结果 3株Hps的16S r RNA基因全长均为822 bp,彼此间核苷酸序列同源性为99.3%~99.6%,与参考菌株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.4%;基于16S r RNA基因序列绘制的系统进化树显示,本研究中家养野猪源Hps和地方土猪源Hps均属于血清5型,而良种猪源血清5型Hps却与血清12型和血清14型的亲缘关系更近。表明Hps在良种猪、家养野猪和地方土猪之间彼此交叉感染或具有共同来源;并非所有血清5型Hps分离株都属同一分支。     

鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的单链构象多态性分析

鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）可导致较高的死亡率和淘汰率,其流行给我国养鸭业造成了巨大的经济损失.对该病的准确诊断依赖于细菌的分离和鉴定.以往鉴定RA时,常检测其培养特性、形态染色反应、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标,但RA常缺乏特定的表型特征,迄今还没有建立起选择性的培养基,不同学者检测RA生化反应的结果也不一致.此外,在表型上RA与某些细菌还很相似,因此,仅依据表型却不足以对RA做出准确鉴定,故建立检测RA的分子生物学方法十分必要.     

牛源化脓隐秘杆菌cbpA基因的克隆及原核表达

为研究化脓隐秘杆菌(A.pyogenes) CbpA蛋白的反应原性,本研究以A.pyogenes H1j1005株为模板采用PCR方法扩增cbpA基因,并构建重组表达质粒pET-cbpA,将其转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta (DE53)plysS中,经IPTG诱导,用SDS-PAGE及western blot检测目的蛋白的表达情况及其反应原性.SDS-PAGE分析表明获得了约120 ku的蛋白.Western blot检测表明,CbpA蛋白可以与A.pyogenes阳性血清发生特异性反应,表明其有良好的反应原性.     

禽大肠杆菌的分离与16S rRNA的鉴定

从疑似患有大肠杆菌病的病死鸡群中采取粪便样品,分离病原进行生化鉴定,从8份样品中分离鉴定出6株大肠杆菌。根据细菌16S rRNA 基因的高度保守性,设计合成大肠杆菌的共同引物,对随机选取的1株细菌进行PCR扩增,并与GenBank中的E.coli 16S rRNA进行序列比对,确定这株细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌提供了一种简单、容易操作的手段。     

家养野猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

对江西省某家养野猪场临诊疑似副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,Hps）感染的病例进行细菌分离鉴定,PCR扩增分离菌株的16SrRNA并进行测序分析,并对分离菌进行细菌形态、生化鉴定和PCR鉴定及序列比对分析。结果显示,获得1株家养野猪源Hps分离株（命名为HPJXYZ01）,该分离株与国内外参考菌株序列之闻的同源性为93．1％～99．2％,与本实验室江西省家猪源分离株的同源性为84％～92．1％。结果表明,江西省家养野猪中存在Hps感染,分离株与国内外家猪源Hps间的16SrRNA序列差异不大,Hps16SrRNA核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。     

温氏附红细胞体部分16S rRNA基因的序列测定和分析

从确诊为附红细胞体感染的黄牛无菌采集血样，抽提附红细胞体基因组DNA，用实验设计的能扩增多种动物血营养菌部分16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增，结果扩增出大小约为370bp的DNA片段。PCR产物序列测定和系统进化分析显示，实验获得的核苷酸序列为温氏附红细胞体的16SrRNA基因，与国外报道的温氏附红细胞体的同源性为97％。反映出不同地理株的温氏附红细胞体存在一定的遗传差异，为牛附红细胞体病的诊断和分子流行病学研究提供科学依据。