3种鱼类致病菌粗脂多糖(LPS)对斑点叉尾鮰的免疫原性

用温酚法分别从柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)3种鱼类致病菌中提取粗脂多糖(LPS)作为免疫原,分别接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatusRafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性以及对A.hydrophila活菌细胞内的杀菌活性,探讨了3种致病菌的粗LPS对斑点叉尾鮰的免疫原性。结果表明,从3种致病菌中提取的粗LPS对斑点叉尾鮰均具有较强的免疫原性,受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鱼相比,头肾和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A.hy-drophila活菌杀菌活性明显上升。说明在3种供试菌的粗LPS上不同程度地存在3种致病菌的共同保护性抗原。     

斑点叉尾鮰对3种致病菌外膜蛋白(OMP)的免疫应答

利用从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)中提取的外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)作为免疫原,注射接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus Rafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和采用A. hydrophila活菌攻毒方法,比较了3种致病菌OMP对斑点叉尾鮰的免疫原性。试验结果表明:从3种致病菌中提取的OMP对斑点叉尾鮰均具有较强的免疫原性,受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鱼相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A. hydrophila活菌攻毒的相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)明显上升。说明在3种供试菌的OMP上不同程度地存在共同保护性抗原。     

斑点叉尾鮰对3种致病菌灭活菌苗的免疫应答

将经福尔马林灭活的柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi-la)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)作为免疫原,分别接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatusRafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性及用A.hydrophila活菌攻毒的方法,探讨了斑点叉尾鮰对3种灭活菌苗的免疫应答状况。试验结果表明,对斑点叉尾鮰经腹腔注射接种3种灭活菌苗能刺激受免鱼产生较强的免疫应答,受免鱼产生了对3种致病菌的特异性凝集抗体和交叉凝集抗体,与未接种菌苗的对照鱼相比,受免鱼头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性明显上升,活菌攻毒的结果也证明了受免斑点叉尾鮰对C.columnaris,A.hydrophila和E.ictaluri产生了不同程度的相对免疫保护率(RPS)。     

中华鳖对嗜水气单胞菌粗脂多糖(LPS)的免疫应答

将采用温酚法从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)中提取的粗脂多糖(crude lipopolysaccharide,LPS)作为免疫原,注射接种中华鳖(Pelodiscus sinensis)后,通过测定受免鳖的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和对A.hydrophila活菌细胞内杀菌活性,比较了3种致病菌的粗LPS对中华鳖的免疫原性。试验结果表明,从3种致病菌中提取的粗LPS对中华鳖均具有较强的免疫原性,受免鳖的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鳖相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A.hydrophila活菌杀菌活性明显上升。说明在3种供试菌的粗LPS上不同程度地存在3种致病菌的共同保护性抗原。     

斑点叉尾鮰暴发性败血症的免疫预防研究

通过试验确定了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)全菌苗的福尔马林安全灭活浓度、最佳灭活温度及时间,并选取最佳灭活方式,制备了全菌苗F-1、F-2和F-3。采用所得全菌苗免疫斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus),测定了其对斑点叉尾鮰的免疫原性。经注射接种28d后,受免斑点叉尾鮰血清中凝集抗体效价都有显著增加。受免斑点叉尾鮰血液白细胞吞噬活性的测定结果表明,3个免疫组的吞噬百分比和吞噬指数都显著地高于对照组。这表明,采用福尔马林灭活的全菌苗F-1、F-2和F-3,均能在28d内刺激斑点叉尾鮰产生较强的免疫应答。     

酵母复合物对斑点叉尾鮰的免疫调节作用

在饲料中添加定量的酵母复合物,连续投喂斑点叉尾鮰28d后,通过测定供试鱼的增重量、血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、谷丙转氨酶活性（SGPT）、血清总蛋白含量、白细胞吞噬活性以及活菌攻毒后的免疫保护率（RPS）,探讨了酵母复合物对斑点叉尾鮰的免疫调节作用。结果表明,在饲料中添加适量的酵母复合物投喂斑点叉尾鮰,可以使供试斑点叉尾鮰的生长速度较投喂未添加酵母复合物饲料的空白对照组稍快,但是与投喂添加酵母多糖的药物对照组之间没有明显差异;对血清中凝集抗体效价的测定结果表明．试验组与空白对照组、药物对照组之间均未出现差异;试验组和药物对照组鱼体溶菌酶活性和白细胞的吞噬活性较空白对照组鱼体有所上升;对谷丙转氨酶活性（SGPT）的检测结果表明,试验组和药物对照组鱼体的肝功能有所改善;与空白对照组相比,试验组和药物对照组鱼体对嗜水气单胞菌人工感染的抵抗能力有所增强。试验结果证明了酵母复合物对斑点叉尾鮰的免疫系统有刺激作用。     

噬菌蛭弧菌预防和治疗斑点叉尾鮰细菌性败血病的初步研究

进行噬菌蛭弧菌预防和治疗斑点叉尾鮰回细菌性败血病试验，结果：在试验水体中加入嗜水气单胞菌对斑点叉尾鮰进行感染，同时在水体中加入噬菌蛭弧菌，当水中的噬菌蛭弧菌浓度达到10^5个／ml以上时有预防斑点叉尾鮰败血病的效果；采用背肌注射嗜水气单胞菌的方法对斑点叉尾鮰回进行感染，然后在水体中加入噬菌蛭弧菌，结果试验鱼全部死亡，说明噬菌蛭弧菌不能起到治疗斑点叉尾鮰败血病的作用。     

同腹异育银鲫对鱼类3种致病弧菌粗脂多糖的免疫应答

用从鳗弧菌（Vibrio anguillarun)，哈维氏弧菌（Vibrio harveyi)和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)等3种弧菌中提取的菌体粗脂多糖（LPS）作为免疫原，分别经胸鳍基部接种同腹异育银鲫（Carassius auratus gibelio)后，通过测定受免鱼的凝集抗体效价，明和血液中吞噬细胞的吞噬活性和杀菌活性，检测3种弧菌的粗LPS对异有银鲫免疫应答的试验结果。结果表明，3种弧菌的粗LPS对异育银鲫均具有较强的免疫原性，受免鱼的血清中出现对3种弧菌的福尔马林灭活菌体（FKC）的交叉凝集抗体；与对照鱼相比，受免鱼头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性和杀菌活性明显上升，证明在3种弧菌的粗LPS上存在共同保护性抗原，而且这些共同保护性抗原对异育银鲫具有较强的免疫原性。     

斑点叉尾鮰细菌性病原的分离与鉴定

报道从湖北省宜都市和长阳土家族自治县内清江河内养殖网箱中患病斑点叉尾鮰体内和体表分离致病菌的初步鉴定结果。从患病斑点叉尾鮰上共分离19个菌株,经分别采用注射和浸泡法人工感染试验,证明其中11个菌株能导致试验鱼80%~100%的死亡。根据对菌株的形态和生化特性的测定结果,11个菌株中的BH-001、BH-005、BH-009和BH-011等4个菌株属于叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri),而BH-002、BH-015、BH-017和BH-019等4个菌株属于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。而BH-004、BH-013和BH-016等3个菌株尚未能鉴定其种类。     

免疫多糖（酵母细胞壁）对黄鳝免疫保护力的增强作用

在饲料中添加不同剂量的免疫多糖（酵母细胞壁）．连续投喂经注射接种嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）脂多糖（Lipopolysaccharide．LPS）的黄鳝（Monopterus albus）28d后．通过测定供试黄鳝的增重量、血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、谷丙转氨酶活性（SGPT）、血清总蛋白含量、白细胞吞噬活性以及活菌攻毒后的免疫保护率（RPS），探讨了将LPS作为免疫原、免疫多糖作为免疫刺激剂结合使用对受免黄鳝免疫保护力的增强作用。结果表明．用添加100．0mg／kg免疫多糖的饲料投喂受免黄鳝，不仅可以提高受免黄鳝对A．hydrophila LPS的免疫应答水平．也可以增强黄鳝的非特异性免疫力和抵抗A．hydrophila人工感染的能力．同时也证明了在饲料中添加免疫多糖对黄鳝的生长速度和肝脏功能均无不良影响。     

黄芪皂甙对斑点叉尾鮰非特异性免疫和抗病力的影响

分别向基础饲料中添加黄芪皂甙Astragalus membranaceus0（对照组）、300（低剂量组）、500（中剂量组）、800 mg/kg（高剂量组）制备4种试验饲料,饲喂同一家系的1龄斑点叉尾鮰Ictalures punctatus,饲喂期为60 d。以斑点叉尾鮰血清溶菌酶（LSZ）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及肝脏、脾、头肾组织中Toll样受体——TLR2、TLR3表达水平为指标,结合嗜水气单胞菌攻毒试验,探讨了不同剂量的黄芪皂甙对斑点叉尾鮰免疫抗病力的影响。结果表明：中、高剂量组斑点叉尾鮰血清中LSZ、AKP活力均显著高于对照组和低剂量组（P〈0.05）,其中高剂量组血清LSZ活力显著高于其它各组（P〈0.05）,具有明显的剂量效应;与对照组相比,各试验组斑点叉尾鮰血清中SOD活力有所提高,但无显著性差异（P〉0.05）;黄芪皂甙可以显著提高TLR3基因在肝脏中的表达量,低、中、高剂量组斑点叉尾鮰肝脏中TLR3基因的表达量均显著高于对照组（P〈0.05）;高剂量黄芪皂甙可以显著提高TLR3基因在脾、头肾组织中的表达量（P〈0.05）,呈现较为明显的剂量效应;与对照组相比,黄芪皂甙中、高剂量组斑点叉尾鮰脾中TLR5表达量均有显著性提高（P〈0.05）;黄芪皂甙对TLR5基因在肝脏、头肾组织中的表达具有剂量效应,中、高剂量黄芪皂甙可以显著提高TLR5基因的表达水平（P〈0.05）,低剂量组与对照组相比无显著性差异（P〉0.05）。攻毒后试验鱼累积死亡率表明,摄食含有不同剂量的黄芪皂甙饲料以后,斑点叉尾鮰抵抗嗜水气单胞菌感染的能力显著增强,对照组斑点叉尾鮰的最终累积死亡率（61.11%±6.94%）显著高于中、高剂量组（31.11%±3.75%、30.01%±5.34%）（P〈0.05）。上述结果说明：特定剂量的黄芪皂甙可以显著提高斑点叉尾鮰机体的非特异性免疫力,黄芪皂甙可以作为一种安全高效的口服免疫增强剂应用于斑点叉尾鮰健康养殖及病害防治。     

斑点叉尾鮰败血症3种病原多重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症3种病原(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌)的多重PCR检测方法。【方法】根据嗜水气单胞菌溶血素基因(Hly)、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因(DNaseⅠ)以及鮰爱德华菌溶血活化基因(Eha)的保守序列,设计3对特异性引物,优化并建立斑点叉尾鮰败血症3种主要病原菌的多重PCR方法,对其特异性和灵敏度进行考察,并将其用于临床样品的检测。【结果】建立的多重PCR方法,当Hly基因、DNaseⅠ基因以及Eha基因的引物浓度分别为1.0,1.0和0.5μmol/L,退火温度为59.5℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌分别扩增出1 091,262和450bp的目的片段,从多种细菌DNA的混合种也可扩增出上述目的片段,而对其他对照组的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,建立的多重PCR最低可分别检测出200CFU/mL的嗜水气单胞菌、300CFU/mL的维氏气单胞菌和200CFU/mL的鮰爱德华菌;对临床样本的检出率为100%,与传统生物学检测结果的符合率为100%。【结论】建立的多重PCR检测方法特异、灵敏、快速,可单独或同时检测斑点叉尾鮰败血症嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种主要病原菌,也可以用于其他水生动物上嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌的检测。     

罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

为深入了解罗非鱼和斑点叉尾鮰免疫机理及建立相关免疫检测方法,采用rProtein A Sepharose亲和层析一步法纯化罗非鱼和斑点叉尾鮰血清免疫球蛋白（IgM）,并制备其兔抗血清.结果表明,rProtein A Sepharose亲和层析法可以较好地分离获得高纯度的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM,通过SDS-PAGE电泳检测,发现罗非鱼血清IgM重链和轻链分子量分别为88.0、21.0 kDa,斑点叉尾鮰血清IgM重链分子量为101.0 kDa.以纯化的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,间接ELISA检测其效价分别为1∶32000和1∶16000;Western blotting检测分析,发现罗非鱼和斑点叉尾鮰的兔抗血清分别在88.0和101.0 kDa附近各出现1条反应条带,说明其兔抗血清具有免疫活性.     

异育银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答

采用神尔马林灭活的嗜水气单胞菌（Aeromondas hydrophila)菌苗免疫接种异育银鲫，通过测定受免鱼血清中凝集抗体效价，溶菌酶活性，血液中吞噬细胞的吞噬活性，杀菌活性并通过鱼体攻毒试验，探讨了异育银鲫对福尔马林灭活的嗜水气单胞菌菌苗的免疫应答状况，结果表明，接种28d后，受免鱼血清中凝集抗体效价和溶菌酶活性均值分别为1：18.89和156.36U/dml，相应的对照组则为1：0.83和138.68dU/ml；受免鱼血中白细胞吞噬百分比和吞噬指数分别为63.38%和6.02，而对照组的分别库存47.95%和5.08；免疫组和对照组白细胞的杀菌指数分别为1.59和1.15，受免鱼的免疫保护力达到73.7%。     

酵母复合物对斑点叉尾的免疫调节作用

在饲料中添加定量的酵母复合物,连续投喂斑点叉尾28d后,通过测定供试鱼的增重量、血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、谷丙转氨酶活性(SGPT)、血清总蛋白含量、白细胞吞噬活性以及活菌攻毒后的免疫保护率(RPS),探讨了酵母复合物对斑点叉尾鮰的免疫调节作用。结果表明,在饲料中添加适量的酵母复合物投喂斑点叉尾,可以使供试斑点叉尾的生长速度较投喂未添加酵母复合物饲料的空白对照组稍快,但是与投喂添加酵母多糖的药物对照组之间没有明显差异;对血清中凝集抗体效价的测定结果表明,试验组与空白对照组、药物对照组之间均未出现差异;试验组和药物对照组鱼体溶菌酶活性和白细胞的吞噬活性较空白对照组鱼体有所上升;对谷丙转氨酶活性(SGPT)的检测结果表明,试验组和药物对照组鱼体的肝功能有所改善;与空白对照组相比,试验组和药物对照组鱼体对嗜水气单胞菌人工感染的抵抗能力有所增强。试验结果证明了酵母复合物对斑点叉尾的免疫系统有刺激作用。     

斑点叉尾鮰套肠病发病情况分析

斑点叉尾鮰套肠病是近几年在我国发生的一种新型的细菌性传染病,危害很大,已经连续几年造成了大批的斑点叉尾鮰发病死亡。通过调查研究发现:斑点叉尾鮰套肠病是由嗜麦芽寡养单胞菌引起的,主要在每年的3月下旬或4月初开始发病,主要发病季节是在春夏,3—5月为其高发期,发病的鱼体鳍条基部、腹部等处充血、出血,肛门红肿出血,有的出现脱肛现象,肠道出现肠套叠现象,可以通过外用复合碘或沐菌消III型消毒,内服氟苯尼考、硫酸新霉素和应激宁III型进行治疗。     

广西斑点叉尾鮰爱德华氏菌的分离鉴定

在广西2处网箱和2处池塘发病斑点叉尾鮰中分离到4株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、培养特征、生理生化特性鉴定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌,通过PCR检测、PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对,进一步确定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌;致病性试验结果显示,这4株分离菌株具有较强的致病性,能引起斑点叉尾鮰发生爱德华氏菌病;药敏试验结果显示,4株分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、氟哌酸等高度敏感。     

无公害斑点叉尾鮰夏花苗种培育技术

随着无公害斑点叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）成鱼养殖量的快速增加，使本来就趋紧的无公害斑点叉尾鮰苗种供应更加紧缺。因此，推广无公害斑点叉尾鮰苗种培育技术就显得尤其重要，也更能获得高收益。     

患爆发性败血症斑点叉尾鮰病原的分离与鉴定

从患爆发性败血症斑点叉尾鮰肝、脾和肾分离到大量形态和色泽一致的细菌。随机挑选5株细菌注射健康斑点叉尾鮰,感染鱼72 h内全部死亡,且患病症状与自然发病症状一致,确认分离株为斑点叉尾鮰败血症的致病菌。依据其菌落形态、生理生化特征,结合其16S rRNA和gyrB基因序列分析,鉴定5个分离株为蜡样芽孢杆菌。用20种抗微生物药敏纸片对分离株进行药敏实验,发现5株菌均对7种喹诺酮类药物、5种氨基糖苷类药物,麦迪霉素,克林霉素和新生霉素敏感,而对2种头孢菌素类药物和复方新诺明有耐药性。     

斑点叉尾鮰肠败血症PCR诊断方法的建立

为了建立快速、敏感的聚合酶链式反应(PCR)诊断斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的肠败血症技术,作者根据NCBI公布的鮰爱德华氏细菌序列,设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4,对鮰爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验,PCR反应条件的优化以及不同检测材料的比较,同时测试了该方法的特异性和敏感性,并对广西4个市县临床样品进行了检测.结果表明:用该引物可以扩增到与预计大小相符的276 bp鮰爱德华氏菌特异性片段;PCR反应与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、迟缓爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;用该PCR法可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌,检测的最低细菌数为12个,且病鱼内脏组织、菌落及菌液均可直接用于该PCR扩增;临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析和生化鉴定结果一致.因此,本试验中所建立的PCR检测方法在斑点叉尾鮰肠败血症的诊断和防治方面具有较好的应用前景.