Crystal structures of human cytochrome P450 3A4 bound to metyrapone and progesterone

Cytochromes P450 (P450s) metabolize a wide range of endogenous compounds and xenobiotics, such as pollutants, environmental compounds, and drug molecules. The microsomal, membrane-associated, P450 isoforms CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, and CYP1A2 are responsible for the oxidative metabolism of more than 90% of marketed drugs. Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) metabolizes more drug molecules than all other isoforms combined. Here we report three crystal structures of CYP3A4: unliganded, bound to the inhibitor metyrapone, and bound to the substrate progesterone. The structures revealed a surprisingly small active site, with little conformational change associated with the binding of either compound. An unexpected peripheral binding site is identified, located above a phenylalanine cluster, which may be involved in the initial recognition of substrates or allosteric effectors.     

桔小实蝇P450基因CYP6A41的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)P450基因,研究其在不同组织及发育时期的表达情况,探索其可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆桔小实蝇P450基因CYP6A41;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究CYP6A41mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。采用Homology程序模拟构建CYP6A41蛋白的三维结构,应用CDOCK程序将之与甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲基丁香酚3种气味分子进行模拟对接分析。【结果】克隆获得了桔小实蝇P450基因,并命名为CYP6A41。CYP6A41阅读框全长1 530 bp,编码509个氨基酸,该蛋白序列与桔小实蝇的另外一种P450蛋白CYP4D46序列的一致性最高,达99.2%。荧光定量PCR分析表明,CYP6A41在桔小实蝇不同发育时期都有表达,并且在化蛹第1天表达量达到最高峰;CYP6A41在各组织中也都有表达,但以触角中的表达量最高;雄虫生殖节中的表达量约是雌虫的6.8倍;对接结果表明,CYP6A41蛋白与3种小分子化合物均能形成稳定的复合物。【结论】CYP6A41在桔小实蝇雌雄生殖节中的差异表达,暗示该蛋白在雄虫生殖生理过程中发挥作用;CYP6A41在化蛹第1天及触角中的高表达量暗示CYP6A41不仅参与了蛹早期的发育过程,且可能参与了嗅觉气味分子的降解过程。     

木薯氰化物合成限速酶CYP79D2基因克隆与序列分析

 亚麻苦苷和百脉根甙等氰化物是木薯块茎、茎叶等组织或器官中的剧毒物质,细胞色素p450是调控氰化物生物合成的关键酶基因,克隆有关酶基因对于理解木薯氰化物代谢和通过转基因对木薯氰化物的改良具有重要意义。根据国际数据库中的木薯氰化物合成限速酶基因序列信息,设计特异引物,通过同源克隆法,从木薯中克隆出1626bp cDNA基因序列。序列分析表明,克隆基因共编码541个氨基酸,与数据库中的木薯CYP79D2基因在核苷酸序列、氨基酸序列同源性上均达到99％,并含有相应基因家族的保守区域,确定克隆到木薯CYP79D2全长基因。     

Identification,Characterization, and Expression of P450 Gene Encoding CYP6BQ13v2 from the Red Flour Beetle,Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae）

An allele of CYP6BQI3, named CYP6BQ 13v2 （GenBank accession no. FJ209361）, was isolated from the red flour beetle, Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae） by RT-PCR. The cDNA sequence of CYP6BQ13v2, 1 563 bp in length, contains an open reading frame of 1 554 nucleotides encoding a putative protein of 518 amino acid residues with a predicted molecular weight of 59.92 kDa and a theoretical pl of 7.60. The putative protein contains the classic hemebinding sequence motif F××G×××C×G （residues 456-465） conserved among all P450 enzymes as well as other characteristic motifs of all cytochrome P450s. It shares 98% identity with the previously published sequence of CYP6BQ13 （GenBank accession no. XP967146） from the T. castaneum genome project. Phylogenetic analysis of amino acid sequences from members of various P450 families indicated that there was closer phylogenetic relationship of CYP6BQ 13v2 with CYP302A1 and CYP307A1 mediating synthesis of the insect molting hormone, distant relationship with CYP6B1 metabolizing plant allelochemicals, CYP6D 1 linking to pyrethroid resistance and other members of CYP6 family. Expression test of the gene in the adults and immature stages of T. castaneum by quantitative real-time PCR revealed that CYP6BQ13v2 is expressed in all life stages investigated. The mRNA expression level in 1st instar larvae was 14.9- and 3.86-fold higher than those in pupae and adults, respectively. The CYP6BQ13v2 expression levels appeared in the order of 1st instar larvae, followed by 4th instar larvae, 7th instar larvae, adult, and pupae from high to low. The more bioinformation of CYP6BQ 13v2 was also analyzed.     

Carbamylation and binding constants for the inhibition of acetylcholinesterase by physostigmine (eserine)

The kinetic treatment and experimental procedures which have been used to evaluate the binding and phosphorylation rate constants of organophos phate inhibitors were applied to the carbamate inhibitor eserine. The binding constant K(I)carbamylation rate constant k(2e)for the inhibition of acetyl cholinesterase by eserine were successfully evaluated.     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450CYP30581V1基因的诱导表达特征研究

1材料与方法 1．1材料与试剂野桑蚕采自苏州大学独墅湖校区桑园;宿主菌E．coli TOP10为苏州大学基础医学及生物科学学院生物资源与功能基因组学研究室保存;植物次生性物质芸香苷和内源性物质蜕皮激素均购自SIGMA公司;氯氰菊酯购自拜耳杭州作物科学有限公司;外源性化合物NaF（分析纯）购自西安化学试剂厂;RNAiso reagent试剂盒购自TakaRa公司;其他常用试剂购自TaKaRa公司或上海生工生物工程技术服务有限公司：     

棉铃虫细胞色素P450家族 CYP6AE14 基因克隆、序列分析及蛋白原核表达

采用同源克隆技术克隆石河子棉区棉铃虫抗性品系的P450家族解棉酚基因 CYP6AE14 。克隆获得的目的基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸。序列分析表明,该抗性品系的 CYP6AE14 有1个氨基酸发生突变,即Y25F;其与烟草天蛾的CYP6AE32同源性较高,达60%。利用原核表达载体pET28 a在大肠杆菌中成功表达棉铃虫P450 CYP6AE14 基因,为进一步的基因功能验证奠定基础。     

速眠新对大鼠原代肝细胞CYP3A1、CYP2E1的影响

胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞,用不同浓度的速眠新和保定宁处理,Western blot法测定肝细胞中细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP 2E1)的表达水平.结果表明:通过胶原酶灌流法,每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞,成活率约为95%.用速眠新、保定宁处理后,肝细胞CYP3A1和CYP2E1的表达随速眠新、保定宁浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势.原代大鼠肝细胞可用于速眠新药物代谢分子机制的研究,为其临床上合理地应用提供了理论依据.     

Vitamin D receptor as an intestinal bile acid sensor

The vitamin D receptor (VDR) mediates the effects of the calcemic hormone 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3]. We show that VDR also functions as a receptor for the secondary bile acid lithocholic acid (LCA), which is hepatotoxic and a potential enteric carcinogen. VDR is an order of magnitude more sensitive to LCA and its metabolites than are other nuclear receptors. Activation of VDR by LCA or vitamin D induced expression in vivo of CYP3A, a cytochrome P450 enzyme that detoxifies LCA in the liver and intestine. These studies offer a mechanism that may explain the proposed protective effects of vitamin D and its receptor against colon cancer.     

蚯蚓细胞色素P450基因的克隆及序列分析

蚯蚓是一种土壤环境的指示生物,参与土壤中有毒化学物质的降解等过程。细胞色素P450酶是动物体内参与外源化合物代谢的主要酶系。本实验通过已有的其他物种的细胞色素P450酶保守序列设计简并引物,用RT-PCR的方法成功扩增出了赤子爱胜蚓体内的一条P450序列(670bp左右,Genbank登录号:KF823788),并对其保守区域、氨基酸构成及三级结构进行了分析。这是首次从蚯蚓体内扩增出P450基因,为下一步从基因层次研究蚯蚓机体对外源化合物的解毒功能及其机理提供了参考。     

密度与氮素水平对小黑麦群体动态、产量及构成因素的影响

以小黑麦东农5305为材料,设置氮水平和栽培密度两个因子,施氮量0、75、150、225kg·hm-2;密度300、450、600万株·hm-2,研究了不同密度与氮素水平对小黑麦分蘖成穗及产量构成的影响。结果表明,东农5305在300万株·hm-2、75kg·hm-2处理时茎蘖成穗率最高,产量也最高。由此可知,对于分蘖能力较高的东农5305应适当降低基本苗,少施氮肥,主攻穗粒数和千粒重,实现高产。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450 CYP305B1V1基因的诱导表达特征研究

[目的]研究不同诱导物对野桑蚕各组织中细胞色素P450CYP30581V1基因表达的影响。[方法]参照GenBank中公布的野桑蚕CYP305B1V1基因的mRNA序列,设计1对引物,采用半定量RT-PCR方法分析经NaF、芸香苷、氯氰菊酯和蜕皮激素处理的野桑蚕各组织中CYP305B1V1基因的表达情况,并对该基因的氨基酸序列进行同源性比较和进化分析。[结果]氯氰菊酯、芸香苷和NaF影响野桑蚕6TP305B1V1基因在组织中的表达,蜕皮激素无明显影响。氨基酸的同源性分析表明该基因氨基酸序列与家蚕CYP305B1的氨基酸序列同源性最高（100％）;与赤拟谷盗推测的CYP305A1、蜜蜂推测的CYP305A1、果蝇CYP305A1、冈比亚按蚊CYP305A2及库蚊CYP2L1有较高的同源性。[结论]野桑蚕CYP30581V1基因可能主要参与外源性化舍物的代谢,对揭示细胞色素P450的功能和不同药物的代谢机理具有重要意义。     

多溴联苯醚对大鼠肝细胞CYP1A2依赖性MROD活性的影响

采用未成熟SD大鼠肝细胞微粒体为试验材料,以2,3,7,8-四氯-二苯基-并-二哑噁英(2,3,7,8- tetrachlorobenzo-p-dioxin,TCDD)作为参照,利用甲氧基-异酚噁脱甲基酶(methoxyresorufin-O- demethylase,MROD)竞争性抑制动力学和荧光光谱法分析法,测定了5种多溴联苯(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)对7-甲氧基-异酚噁唑脱甲基反应的影响,间接研究了这些PBDEs对CYP1A2 的竞争性抑制作用。结果表明,和TCDD相比,PBDEs对MROD活性的抑制作用较弱,亦即对CYP1A2的 竞争性抑制作用较弱。     

复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影响

建立肉鸭aflatoxin B1（AFB1）慢性中毒模型,设立正常组、模型组、亚硒酸钠组、复方柴芩颗粒（中药）高、中、低剂量组。造模后第7,14和21天处死肉鸭取肝,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肝标本中CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性。结果表明,与模型组相比,中药高、中、低剂量组用药7和14 d后肝脏微粒体细胞色素P450酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性显著降低;用药21 d后CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性升高,但与模型组相比差异不明显。说明前期复方柴芩颗粒通过抑制CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性,减少AFB1前体物质代谢激活,降低其化学性肝脏损伤达到保护肝脏的作用。而用药后21 d CYP450活性升高的原因可能是AFB1蓄积较多,需要更多的CYP450代谢AFB1。     

小立碗藓细胞色素P450基因CYP73A49的克隆与功能分析

本研究克隆了一个小立碗藓（Physcomitrella patens）P450基因CYP73A49,其cDNA全长1629bp,预测编码542个氨基酸。为了进一步研究其生物学功能,利用同源重组技术对CYP73A49基因实施定点突变,成功构建了能诱导其功能缺失的载体,并获得了苔藓的功能缺失突变体。     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

Late Proterozoic and Paleozoic Tides, Retreat of the Moon, and Rotation of the Earth

The tidal rhythmites in the Proterozoic Big Cottonwood Formation (Utah, United States), the Neoproterozoic Elatina Formation of the Flinders Range (southern Australia), and the Lower Pennsylvanian Pottsville Formation (Alabama, United States) and Mansfield Formation (Indiana, United States) indicate that the rate of retreat of the lunar orbit is dxi/dt approximately k2 sin(2delta) (where xi is the Earth-moon radius vector, k2 is the tidal Love number, and delta is the tidal lag angle) and that this rate has been approximately constant since the late Precambrian. When the contribution to tidal friction from the sun is taken into account, these data imply that the length of the terrestrial day 900 million years ago was approximately18 hours.     

小麦籽粒次生物质对麦红吸浆虫幼虫解毒酶活性及基因表达的影响

【目的】明确小麦灌浆期籽粒次生物质含量与麦红吸浆虫（Sitodiplosis mosellena）幼虫谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase,GST）、羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）和细胞色素P450 酶系（cytochrome P450,CYP450）活性及相关基因表达的关系,探讨次生物质在小麦对麦红吸浆虫抗性中的作用及麦红吸浆虫的解毒代谢机制。【方法】2016年5月采用剥穗调查法对陕西省周至县试验田种植的4个抗虫和4个感虫小麦品种（系）进行麦红吸浆虫幼虫危害调查,并收集各品种（系）灌浆期籽粒及取食各品种（系）灌浆期籽粒的麦红吸浆虫幼虫;采用比色皿法、香草醛法、Folin-Ciocalteu法和亚硝酸钠-硝酸铝显色法分别测定收集的小麦籽粒阿魏酸、单宁、总酚和总黄酮含量,酶联免疫吸附法和qPCR方法分别检测收集的麦红吸浆虫幼虫GST、CarE和CYP450活性及其编码基因GST1、CarE2和CYP6A1 mRNA表达水平,分析次生物质含量与小麦对麦红吸浆虫抗性以及麦红吸浆虫解毒酶活性和基因表达的相关性。【结果】不同小麦品种（系）灌浆期籽粒阿魏酸、单宁、总酚和总黄酮含量差异明显,其中阿魏酸和单宁含量以抗虫品种科农1006最高,总酚含量以抗虫品种晋麦47最高,总黄酮含量以感虫品种西农88最高;取食不同品种（系）小麦的吸浆虫幼虫GST、CarE和CYP450活性及GST1、CarE2和CYP6A1表达水平差异亦明显,GST和CarE活性分别以取食抗虫品种科农1006和陕麦139的最高,CYP450活性以取食感虫品种小偃6号的最高;GST1和CarE2表达水平在取食抗虫品种的幼虫中均高于取食感虫品种,CYP6A1表达水平在取食抗、感性品种的幼虫中表现无规律。相关分析表明,小麦籽粒阿魏酸含量与穗被害率、粒被害率、单穗虫口和估计损失4个小麦对吸浆虫的抗性指标均呈显著负相关（P<0.05）,单宁、总酚和总黄酮含量与4个指标相关性不显著。取食不同品种（系）小麦的吸浆虫幼虫GST和CarE活性与小麦籽粒阿魏酸含量呈显著正相关,CYP450活性与单宁含量呈显著负相关（P<0.05）,总酚和总黄酮含量与3种解毒酶活性相关性不显著;GST1和CarE2表达水平分别与其GST和CarE活性呈显著正相关（P<0.05）,但CYP6A1表达水平与CYP450活性相关性不显著。【结论】阿魏酸是小麦抗麦红吸浆虫的主要次生物质,能够诱导麦红吸浆虫幼虫GST、CarE活性和相关基因的表达,它们共同作用参与麦红吸浆虫对小麦次生物质的代谢和适应。