球毛壳菌cox5基因克隆及特性分析

利用BlastX将球毛壳菌(Chaetomium globosum)ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性搜索,获得含有细胞色素c氧化酶亚基5基因(cox5)全长cDNA序列的EST(BP099084),以此设计引物。以球毛壳菌总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增,获得球毛壳菌cox5的cDNA序列。cDNA全长685bp,编码169个氨基酸的多肽,蛋白质分子量18.3KD。蛋白质家族预测其属于cox4家族。球毛壳菌cox5是具有导肽的跨线粒体内膜的蛋白质。BlastP相似性分析表明cox5氨基酸序列保守性不高,与其相似性最高的是柄孢霉的cox5(Podospora anserina,CAB76570),相似性为75%。cox5基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank上登录(登录号分别为DQ082750、AAY85812)。     

球毛壳菌二烯醇内酯水解酶基因克隆及序列分析

以球毛壳茵cDNA文库中获得的二烯醇内酯水解酶基因片段(GenBank Accn：BP099060)为基础,用RACE技术克隆出该基因的全长cDNA序列。序列长919bp,由450bp的3’RACE产物和608bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框762bp,编码253个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为27．5kD,理论等电点为5．98。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成,外显子与内含子剪连接区符合AG—GT规则。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY465528,AY555772,AAS66899)。     

球毛壳菌几丁质酶3基因的序列分析

根据EST分析的结果，从cDNA文库中挑取几丁质酶3基因的克隆进行了测宁并序列分析。结果表明：cDNA文库中几丁质酶3基因的克隆插入片断大小为1268bp；用Phrap软件拼接出来的几丁质酶3的表达序列标签拼接序列与实际平列不完全吻合：因此，在EST分析中不用Phrap软件为好。     

油菜内生球毛壳菌抑菌作用初步测定

平板对峙试验显示,从油菜(Brassicanapus)叶、根和种子上分离到的14株内生球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)对油菜菌核病原菌和立枯丝核菌均有不同程度的抑制作用,其中以种子上分离到的Dyst-1和MYNS-1的抑制作用最好。Dyst-1和MYNS-1的发酵液通过高压湿热灭菌和细菌过滤器过滤灭菌后,分别对所选用的几株植物病原真菌表现出抑制作用,特别是对油菜种传病害菌核病病菌。油菜内生球毛壳菌的详细抑菌机制需进一步研究。     

石榴叶斑病球毛壳菌生长习性及杀菌剂筛选

采用生长速率法研究了云南蒙自石榴叶斑病球毛壳菌菌丝生长的条件及有效杀菌剂。结果表明,球毛壳菌菌丝在26~34℃均能生长,适宜温度是26~32℃,最适温度为28℃;偏好75%~85%的相对湿度,最适相对湿度为85%;光照促进菌丝生长;pH值4.5~7.5时均适宜于球毛壳Bd-2菌丝的生长,最适pH值为6.5,表明该菌偏好弱酸性环境。不同碳源、氮源对球毛壳菌菌丝生长的影响均较明显,麦芽糖和蛋白胨对菌丝生长有显著的促进作用。随后,分别用75%百菌清、80%甲基硫菌灵和80%代森锰锌等3种常见杀菌剂,以及细辛、小桐子和夹竹桃等3种植物提取液在培养基上进行抑菌实验,从菌丝生长的抑制率大小初步鉴定80%甲基硫菌灵为该病害的有效杀菌剂;在3种植物提取液中,细辛提取液对球毛壳Bd-2的菌丝生长抑制率最高,4 mg·mL~(-1)抑菌率达100%。明确了云南蒙自石榴叶斑病球毛壳菌生长的环境条件及有效杀菌剂,为生产上化学防治提供了选择杀菌剂的理论基础。     

毛壳菌产抗真菌活性物质菌株的筛选与鉴定

对实验室分离保存的40株毛壳菌菌株代谢产物进行抗真菌活性筛选,5个菌株代谢产物对植物病原真菌具有选择性抑制效果。其中,菌株CH08、CH23发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽菌、小麦根腐菌有较强的抑制作用;菌株CH16、CH17发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽病具有较强的抑制作用;菌株CH21发酵液对西瓜枯萎菌、辣椒炭疽菌有较强的抑制作用。经形态学鉴定,CH08、CH16、CH17、CH23为球毛壳菌,CH21为角毛壳菌。     

球毛壳菌荧光标记与重寄生现象研究

    球毛壳菌是一种非常重要的生防真菌.为了从分子生物学水平研究球毛壳菌与立枯丝核菌的拮抗机制,选用GFP(green fluorescent protein)作为报告基因对球毛壳菌进行标记.通过构建和转化EGFP(Enhanced GFP)表达载体,得到氯嘧磺隆抗性的转化子.经过几轮验证筛选,包括选择性平板筛选、PCR扩增目的片段验证、Southern杂交、荧光镜检等,确认SUR基因和EGFP基因已经插入球毛壳菌的基因组并在其中表达标记.取一个确认为荧光标记转化子的菌株,进行生防特性分析.主要通过与病原真菌平板共培养、载玻片对峙培养等方法初步研究了球毛壳菌与立枯丝核菌的拮抗机理.结果发现,在对立枯丝核菌的抑制过程中,球毛壳菌的拮抗机理主要是重寄生作用.     

病原菌细胞壁诱导下球毛壳菌葡聚糖酶活测定及抑菌试验

通过对峙培养试验,研究球毛壳菌对稻瘟病菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌及核盘菌4种植物病原菌生长的抑制作用,结果表明,球毛壳菌对稻瘟病菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌生长抑制作用更明显。在6种植物病原真菌细胞壁诱导下,球毛壳菌可产生β-1,3-葡聚糖酶,但是产酶规律不同。在稻瘟病菌、立枯丝核菌和尖孢镰刀菌细胞壁诱导下,β-1,3-葡聚糖酶活要明显高于杨树烂皮病菌、核盘菌和叶枯菌。其中,在稻瘟病菌细胞壁诱导11 d后,酶活达到最高,为0.61 U;而杨树烂皮病菌和叶枯菌细胞壁的诱导产酶效果最差。球毛壳菌可作为生物防治真菌。     

来源于角毛壳茵的木聚糖酶xyn24基因克隆及特性

利用Blastx将角毛壳茵(Chaetomium cupreum)ESTs与GenBank的Nr数据库进行相似性比对,获得1条编码木聚糖酶基因的全长cDNA序列的EST( GenBank Accn:DV547992),依据该序列设计并合成引物,以角毛壳茵基因组为模板进行PCR扩增,获得角毛壳菌xyn24的全长DNA序列...     

内生真菌球毛壳ND35对植物抗病性及防御酶活性的影响

以植物内生真菌球毛壳菌ND35菌株和病原真菌立枯丝核菌Rs-1菌株及毛白杨树组培苗为试材,分析检测了接种球毛壳菌后立枯丝核菌侵染杨树组培苗的发病情况和4种不同处理的植物产生过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化。结果表明:与对照相比接种球毛壳菌后的植物在一定程度上能够阻止立枯丝核菌的扩展,发病率和病情指数均有所降低,明显提高植物POD、PPO和PAL的酶活性。说明接种球毛壳菌后诱导植物产生的3种防御酶对提高植物抗病性有一定的影响。     

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。     

来源于Chaetomium cupreum的几丁质酶chi58基因克隆及特性分析

以角毛壳菌cDNA文库中获得的几丁质酶基因片段(GenBank Accn:DV546055)为基础,用反向PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,命名为chi58。其开放阅读框(ORF)1602bp,编码533个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为58kD,理论等电点为4.47。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成。经BlastP分析,chi58基因的氨基酸序列的保守性不高,与其相似性最高的是球毛壳菌(Chaetomium globosum XM001230073),相似性为75%。表明该基因是一条新发现的几丁质酶家族基因。该序列已收录于GenBank,登录号为EF026977,DQ886936。     

球毛壳菌及其产生的鞘氨醇对油菜根肿病的室内生防作用

采用灌根接种法研究内生真菌球毛壳菌(Chaetomium globosum)对油菜根肿病的室内生防作用。结果表明,灌根接种球毛壳菌孢子悬浮液后,油菜体内的过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶的活性均明显提高。球毛壳菌孢子悬浮液灌根接种油菜根部后,根肿病的发病率和病情指数均明显降低,对油菜根肿病的防效为76.88%。通过极性梯度萃取、薄层层析和HPLC从球毛壳菌发酵液中分离纯化活性物质,经质谱鉴定为C16鞘氨醇和植物鞘氨醇。鞘氨醇对根肿菌休眠孢子的萌发有明显的抑制作用,其MIC值小于0.1μg/mL,表明球毛壳菌防治油菜根肿病的机制为诱导系统抗性和次生代谢产物拮抗病原菌2种机制。     

月季花瓣丝氨酸蛋白酶基因RhSep1的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术,从切花月季品种"Samantha"中克隆丝氨酸蛋白酶基因RhSep1。利用生物信息学技术对所得到的丝氨酸蛋白酶RhSep1序列进行结构与功能预测。结果表明:RhSep1基因全长2 442 bp,开放阅读框编码769个氨基酸,推定该丝氨酸蛋白酶分子质量为80.48 kD。通过NCBI和MEROPS肽酶数据库等对Rh-Sep1进行Protein Blast,发现RhSep1具有肽酶S8₃家族SA的典型结构域Petidase_S8₃（序列为Tyr-108-Leu-341）和PA_subtilisin_like的结构域（序列为Tyr-348-Ile-474）。预测RhSep1可能具有信号肽、明显疏水区和典型跨膜区,同时RhSep1氨基酸序列中存在较多蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、豆蔻酰化位点。这些活性位点往往与蛋白的磷酸化、G蛋白相互作用等信号转导事件有关,RhSep1可能存在复杂的蛋白水平调控机制。     

球毛壳菌ACCC30566木聚糖酶生产低聚木糖的研究

利用玉米芯生产粗木聚糖,再用球毛壳菌 ACCC30566木聚糖酶液酶解粗木聚糖,获得低聚木糖,最后对低聚木糖进行提取纯化,并用薄层层析法初步测定了低聚木糖成分.结果表明:球毛壳菌ACCC30566木聚糖酶酶解产物主要成分为木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖,葡萄糖含量较少.该菌株所产木聚糖酶成分较纯,纤维素酶含量较低.可以用来生产低聚木糖.     

生防真菌球毛壳ND35的RAPD特异序列的标记转换

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对包括球毛壳ND35在内的20个真菌分离物进行分析,筛选出球毛壳ND35的RAPD扩增特异性DNA片段,经pEASY—T3载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primer5．0软件设计了球毛壳ND35的特异引物对CgND35—1：GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG,CgND35—2：G111ACCAGCCATGCCTTGAAG,经优化PCR条件,成功获得球毛壳ND35的SCAR标记,该标记片段长度为329bp。用CgND35—1／CgND35—2引物对进行了SCAR标记特异性和灵敏度检测,表明该特异引物可用于球毛壳ND35的快速检测。