家蚕免疫血清体外抑制神经母细胞瘤细胞生长和增殖

家蚕免疫系统在抵抗病原微生物时会产生一些具有免疫功能的小分子肽,有研究表明这些肽具有抗肿瘤活性。我们通过免疫诱导法,给家蚕注射了一定量的抗原诱导家蚕产生免疫血清。从家蚕体内收集免疫血清,稀释成不同浓度梯度处理神经母细胞瘤细胞系BE(2)C,并观察其对BE(2)C细胞的影响。通过显微镜观察发现免疫血清处理后肿瘤细胞出现了大面积死亡。经MTT方法检测分析后发现,家蚕免疫血清对肿瘤细胞生长有抑制作用。实验结果初步证实了经抗原诱导的家蚕免疫血清对神经母细胞瘤系BE(2)C的生长及增殖有抑制作用,推测家蚕免疫血清可能诱导了肿瘤细胞发生凋亡,为进一步解析其调控机制提供了有力的数据支撑,为开发家蚕新的经济用途奠定了良好基础。     

SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)B细胞表位预测、原核表达及免疫学特性

运用ANTHEPROT 5.0综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测MRP的B细胞优势袁位簇;PCR扩增出表达预测的抗原肽段的基因(mrp-1),构建重组原核表达载体pET32a-mrp-1,IPTG诱导表达,以渗透性休克法纯化重组蛋白;使用重组蛋白免疫血清和灭活猪链球菌2型SS2免疫血清Western blotting检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性;纯化的重组蛋白免疫雌性SPF昆明小鼠,SS2攻毒受试动物评估重组蛋白对小鼠的免疫保护力.Western blotting显示预测的950～1 210 aa肽段与PET32a重组表达的蛋白(MRP)具有良好的免疫原性和反应性;攻毒试验结果表明重组蛋白对小鼠的免疫保护率为菌体免疫所提供保护率的66.7％.研究为利用该细胞表位簇作为高效免疫制剂奠定了基础.     

通用型辅助性T细胞表位增强了猪瘟病毒合成肽抗原的免疫原性

为了探讨通用型辅助性T细胞表位对猪瘟病毒人工合成短肽抗原免疫原性的影响,本研究合成了含有猪瘟病毒E2蛋白线性中和表位的短肽B,合成了含有通用型辅助性T细胞表位的短肽Th-B。同时,为了探讨免疫刺激基序对人工合成短肽抗原免疫原性的影响,合成了含有免疫刺激序列的IS-Th-B。将上述3种合成肽与弗氏佐剂混合乳化后,免疫兔子,比较3种不同的抗原肽诱导的抗体水平,并用猪瘟弱毒对免疫兔子进行攻击,比较抗原肽的免疫保护效果。结果显示,Th-B和IS-Th-B诱导了相当的抗体水平,但显著高于抗原肽B诱导的抗体水平。Th-B和IS-Th-B免疫延迟但没有阻止兔定型热的产生,而抗原肽B免疫兔和未免疫兔一样发生了明显的定型热反应。本研究表明,免疫刺激基序对本研究中的短肽诱导的抗体应答没有产生明显影响,但通用型辅助性T细胞表位增强了短肽抗原的免疫原性。     

家蚕质型多角体病毒的研究

我们以家蚕质型多角体病毒(以下简称CPV)为材料,开展了病毒分子生物学的研究工作。 首先建立了用分子筛凝胶柱层析分离纯化家蚕CPV的方法。这一方法简便迅速,适于大量制备,所得病毒制剂均一,感染活性强,LD_(50)可达1.11×10~(-10)克/每头2龄起蚕。 其次,用分子筛凝胶柱层析提纯的家蚕CPV作为抗原制备了免疫血清,家蚕CPV的抗血清中不仅有效价高的病毒蛋白的抗体,也有双链RNA的抗体存在,这对于研究各种双链RNA病毒之间的关系是很有意义的。 家蚕CPV颗粒中含有以双链RNA为模板的RNA复制酶。我们建立了测定RNA复制酶的方法。并能获得毫克量体外合成的家蚕CPV—mRNA,在麦胚无细胞系统中进行翻译,所合成的蛋白与家蚕CPV抗血清进行免疫对流电泳能产生特异的沉淀线,说明体外合成的家蚕CPV—mRNA具有足够的信息。 家蚕CPV经氯仿、30％乙醇、pH3.8酸性溶液等处理,其复制酶活力显著降低,病毒的感染能力也随之相应下降;用表面活性剂Triton X—100处理家蚕CPV,其复制酶活力提高约27％,感染活力也提高了28％。这些结果说明家蚕CPV所带的RNA复制酶是感染所必需的。     

日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)基因的克隆表达及其免疫保护效果分析

为了评估日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)在小鼠体内诱导的免疫保护效果,应用PCR获得SjNADH基因片段,其开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸,并在大肠杆菌中成功表达,纯化得到该重组蛋白。Western blot结果显示,SjNADH在日本血吸虫童虫和成虫中的表达量稳定,SjNADH融合蛋白也能被免疫血清识别,具有较好的免疫原性。应用重组蛋白免疫小鼠能诱导产生较高的特异性抗体水平,并诱导了20.13%的减虫率和23.06%的肝脏减卵率。结果表明,获得的SjNADH重组蛋白在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护,有作为血吸虫疫苗候选抗原分子的潜力。     

蚕抗菌肽免疫血淋巴对一些肿瘤细胞作用的初步研究

抗菌肽对多种危害人体、动物和农作物的致病菌有广谱的杀菌作用。试验亦发现家蚕抗菌肽能明显抑制某些昆虫病毒包含体的形成。最近的研究还发现无论是纯化的抗菌肽或是免疫血淋巴对多种肿瘤细胞也有明显的抑制作用。主要结果如下:     

一种山羊支原体山羊肺炎亚种多重抗原肽的小鼠免疫试验

旨在构建一种由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum Subsp.capripneumoniae,Mccp)六个B细胞表位和三个T细胞表位组成的多重抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),将其在大肠杆菌中表达后免疫小鼠,评估其体液免疫和细胞免疫。分别用MAP、单个B细胞表位及全菌超破抗原作为抗原,检测免疫小鼠抗体水平,结果显示三种抗原均能和小鼠免疫血清发生很好的反应(P0.01)。体外代谢抑制试验显示,1∶64倍稀释的免疫小鼠血清可以有效抑制Mccp的生长。淋巴细胞增殖试验显示,当用单个T细胞表位及Mccp超破抗原分别刺激免疫小鼠的淋巴细胞时均产生明显的增殖现象(P0.01)。细胞因子检测结果显示,免疫小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10产量明显升高(P0.001),而IL-12产量明显下降(P0.001)。数据显示,构建的MAP能够引起小鼠的免疫反应,这一结果为由Mccp引起的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了一定的基础。     

含有Th细胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表达及免疫原性分析

拟测定在PCV2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从PCV2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的PCV2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞表位多肽和3条PCV2特异的含有Th细胞抗原表位的多肽序列,然后将这4条Th细胞多肽氨基酸序列与筛选自ORF2Cap1上的1条B细胞表位多肽序列进行串联组合,密码子优化,插入酶切位点、终止密码子,然后进行密码子适应指数和分布频率分析,预测可以实现高效表达后再进行化学合成。合成的P1多肽抗原连接到pET-30a表达载体,并转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。经IPTG诱导表达后P1可实现高效表达,SDS-PAGE鉴定表达量,Western Blot鉴定其生物活性,然后分别免疫小鼠和猪,测定小鼠免疫后的抗体水平以及猪免疫后P1合成多肽抗原对外周血淋巴细胞的刺激增殖情况。结果表明,设计合成表达的PCV2P1多肽抗原序列,密码子适应性指数为0.89,能够实现高水平表达,目的片段大小约为28.29ku,具有良好的免疫原性;MTT试验结果表明,P1多肽抗原免疫后机体内IFN-γ和IL-4的表达量明显增加,且与对照组差异显著(P0.05)。这说明P1能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。     

无毒突变肠毒素免疫对金黄色葡萄球菌乳腺感染的免疫效果研究

本研究表达并提纯了无毒诱变葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶重组融合蛋白(GST-mSEC).用GST-mSEC作免疫抗原对小鼠进行免疫,研究其对金黄色葡萄球菌(金葡菌)经乳导管注射感染的免疫效果.试验结果表明,在小鼠乳腺感染金葡菌3 d后,免疫小鼠乳腺的眼观病理变化显著轻于未免疫的对照组,乳腺组织中的菌数也明显低于未免疫的对照组.GST-mSEC免疫小鼠可引起大量的特异性抗体产生,并对葡萄球菌超抗原刺激的炎症性细胞因子的产生具有显著的中和抑制作用.结果表明GST-mSEC融合蛋白及其诱导的特异性抗体对金葡菌引起的乳腺感染具有良好的抗感染作用.     

家蚕AGO2蛋白的单克隆抗体制备

Argonaute(AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择Bm AGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础。通过分析Bm AGO2蛋白的抗原性分布,筛选出Bm AGO2抗原表位区aAGO2,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体p ColdⅡ-aAGO2原核表达aAGO2蛋白,以纯化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠。剖取免疫小鼠脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合。以HAT选择培养基及间接ELISA法筛选阳性克隆,经Western blotting和免疫沉淀检测,获得2株生长状态好、能分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株I5-A9和E1-3。经抗体亚型检测后,选择细胞株I5-A9进行大量培养,菌液注射小鼠腹腔制备的腹水经辛酸-硫酸铵沉淀及Protein A/G亲和层析纯化,获得了纯度较高的Bm AGO2单克隆抗体。利用获得的抗体免疫共沉淀家蚕卵巢培养细胞Bm N以及家蚕5龄幼虫的内源Bm AGO2蛋白,从分离的结合RNA检测到小RNA被显著富集,表明成功制备了可用于免疫共沉淀的Bm AGO2单克隆抗体并分离BmAGO2结合的RNA。     

家蚕二分浓核病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其特异性验证

家蚕二分浓核病毒(Bm BDV) NS1蛋白是一个与病毒复制相关的多功能蛋白。为获得NS1蛋白的单克隆抗体,设计并合成了12条NS1蛋白的抗原表位肽段,分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,获得了18株能分泌抗体的阳性杂交瘤细胞。在大肠埃希菌中表达NS1作为抗原,通过Western blot对所获得的单克隆抗体进行验证。结果表明,由8/C278细胞株获得的单克隆抗体能特异识别重组的NS1蛋白,所用抗原表位序列为DIPPEEYRELRT。利用该抗体能检测到Bm BDV感染家蚕中肠组织中NS1蛋白的表达。该研究为深入探索NS1蛋白的功能打下了基础。     

家蚕组织蛋白酶L及其特异性抑制剂基因参与微生物诱导蚕体的免疫响应研究

给家蚕5龄第3天幼虫分别注射藤黄微球菌(革兰阳性菌)和球孢白僵菌(真菌)进行诱导处理,利用已登录的家蚕组织蛋白酶L基因Bm Cts L(Gen Bank登录号:S77508.1)和Bm Cts L特异性抑制剂基因Bm Cts LI(Gen Bank登录号:AJ131752)的全长序列设计引物,实时荧光定量PCR检测微生物入侵后家蚕组织中Bm Cts L和Bm Cts LI基因的时空表达变化及协同反应,分析Bm Cts L酶活性变化与家蚕对微生物入侵免疫响应的相关性。家蚕的血细胞与脂肪体是微生物入侵后Bm Cts L和Bm CtsLI基因出现表达变化的主要组织,其中经藤黄微球菌诱导后,血细胞中的Bm Cts L基因响应最快,且基因mRNA转录水平极显著上调,脂肪体中的Bm Cts LI基因mRNA转录水平也极显著上调。微生物入侵后蚕体组织中Bm Cts L与Bm Cts LI基因的表达变化存在时间差异,其中Bm Cts L基因先于Bm Cts LI基因上调表达,推测Bm Cts LI基因通过对微生物入侵的协同反应调控BmCts L酶活性变化。藤黄微球菌比球孢白僵菌能更快诱导Bm Cts L和Bm Cts LI基因的表达变化;2种微生物诱导下蚕体血细胞中的Bm Cts L酶活性不仅上升快,而且明显高于其他组织。上述结果提示Bm Cts L和Bm Cts LI可能与家蚕的先天免疫相关,并且佐证了家蚕的血细胞在微生物入侵后能比其他组织更快速地产生免疫响应。     

雏鸡接种超抗原SEB和MDV后免疫细胞TNF-α的体外诱生

超抗原由某些细菌、病毒、支原体和寄生虫产生，其中金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)中SEB具有代表性；已知超抗原(SAg)可大量激活人和小鼠T细胞(CD4^ 和CD8^ )和抗原递呈细胞(APC)，并诱导IL-1、IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ等Th-1细胞因子，乃至免疫无反应、细胞凋亡和免疫抑制；超抗原SEB诱导CD8^ T细胞成为细胞毒性T细胞，启动NK细胞的细胞因子产生，有研究发现，SEB具有双相激活作用，高剂量诱导迅速，低剂量诱导长期而长期的激活状态。     

农药氰戊菊酯和杀虫双诱导家蚕血液蛋白的变化

为了解析家蚕对常用农药氰戊菊酯和杀虫双的解毒机制,分别给家蚕5龄幼虫添食2种农药,观察家蚕对农药的中毒症状,采用双向电泳(2-DE)技术对添食农药的家蚕幼虫的血液蛋白进行分离,利用电喷雾电离(ESI)质谱对具有2次以上重复的显著差异蛋白点进行鉴定,并用生物信息学方法进行分析。家蚕5龄幼虫分别添食1/4LD50剂量浓度的2种农药后,均在3～12h内出现中毒症状,且血液蛋白的表达也发生了变化:在氰戊菊酯诱导下,幼虫血液中增加了纤维样蛋白、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂;在杀虫双诱导下,幼虫血液中增加了丝氨酸蛋白酶抑制剂-13;经2种农药分别诱导处理后3h,幼虫血液中都减少了体液低分子蛋白-Ⅲ的表达。推测家蚕对氰戊菊酯和杀虫双具有一定的免疫反应。     

外源H_2O_2活化家蚕滞育性卵的研究

为进一步探讨H_2O_2与家蚕滞育的关系,研究了外源H_2O_2 活化家蚕滞育性卵的处理方法。发现H_2O_2 的浓度、处理时期和处理时间对活化效果有重要影响,提出了产于连纸的家蚕滞育性卵在产后2 4h(2 5℃)用6 %H_2O_2于4 7℃下处理30min可有效活化家蚕滞育性卵,孵化率达到96 % ;盐酸处理可有效活化经H_2O_2处理不能孵化的滞育性蚕种,表明盐酸和H_2O_2在活化家蚕滞育性卵上有协同作用。     

甲硝唑对地塞米松预处理鸡免疫功能的影响

对地塞米松预处理鸡投以10mg／kg剂量的甲硝唑，观察后者对前者作用的影响。结果表明：地塞米松明显抑制由伴刀豆球蛋白A(ConA)引起的鸡外周血淋巴细胞(PBL)产生IL-2活性，而甲硝唑对这种抑制作用有显著的拮抗作用；地塞米松能抑制鸡对绵羊红细胞(SRBC)悬液和牛血清白蛋白(BSA)两种胸腺依赖性抗原的免疫应答和对布鲁氏菌非胸腺依赖性抗原的抗体应答，但甲硝唑会逆转这种抑制作用；甲硝唑能封闭地塞米松对补体产生的抑制作用。对比实验结果同时表明，在拮抗地塞米松对鸡免疫功能负面影响方面，左旋咪唑与甲硝唑作用非常类似。     

妊娠期激素对Th1和Th2细胞因子的调控

妊娠是一个复杂的生理过程,受到神经、免疫和内分泌的共同调节。作为半自体抗原的胎儿不被母体排斥是子宫局部免疫水平调节的结果。其中激素对辅助性淋巴细胞(Th)发生、分化的调节作用愈来愈受到重视。辅助T淋巴细胞能分化为不同的亚型(Th1和Th2),孕酮可促进Th2型细胞因子(IL-4,IL-5)的产生,有利于妊娠的正常发生;松弛肽促进Th1型细胞因子(IFN-γ)的产生,对妊娠有害。在母胎界面存在激素-细胞因子网络,淋巴细胞产生的细胞因子还能够影响其他细胞因子的产生。由Th2样细胞产生的,对胚泡着床具有非常重要作用的白血病抑制因子(LIF),其表达受Th1细胞诱导因子的下调,如IL-12,IFN-α,IFN-γ,受IL-4和孕酮(诱导T淋巴细胞向Th2细胞分化)的上调。激素通过调控淋巴细胞分泌的细胞因子来调控免疫系统,保持一个动态的平衡,有利于维持妊娠。     

禽呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

通过RT-PCR扩增禽呼肠孤病毒σC基因,经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理后与pET-30a原核表达载体连接,获得重组质粒pET-30a--σC.将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后通过Westem blot分析表明重组目的蛋白获得表达,分子量约为42 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白经纯化后免疫新西兰白兔,三次免疫获得抗σC蛋白的高效免疫血清.经ELISA检测,该血清抗体效价为1:105,并且能够与重组杆状病毒表达的σC蛋白发生特异性反应.禽呼肠孤病毒σC蛋白的表达与兔抗血清的制备为进一步研究该蛋白功能奠定了基础.     

小鼠抗HCMV-gB多克隆抗体的制备及初步应用

为了快速制备抗HCMV-gB小鼠多克隆抗体,通过PCR扩增HCMV-gB(57aa～146aa)编码序列并克隆到原核表达载体pET21b(+)多克隆位点,用重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)并通过IPTG诱导表达,经镍胶亲和层析纯化和透析复性获得重组蛋白。以CpG-ODN和Al(OH)3复合佐剂作为重组蛋白的免疫佐剂,通过0周和3周2次肌肉注射免疫Balb/c小鼠,并在第5周采血分离免疫血清。用ELISA检测免疫血清效价,并通过Western blot检测免疫血清对哺乳动物细胞表达的HCMV-gB1和gB2的反应性。结果显示,本研究制备的免疫血清ELISA滴度达到1∶51 200～1∶102 400,进行Western blot能够与哺乳动物细胞表达的HCMV-gB1和gB2发生特异性反应。此试验获得了能够用于后续研究工作的抗HCMV-gB小鼠多克隆抗体,本方法具有制备速度快、抗体滴度高和抗原用量少等优点。     

表达致PWD和ED保护性抗原重组菌的免疫效力

重组菌BL21（pFsFaeG）是能够同时表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原（F4、F18、Stx 2e）基因的基因工程重组菌。由IPTG诱导的重组菌制成抗原，经甲醛灭活后腹腔免疫小鼠，用间接ELISA法定期检测小鼠血清中的抗体产生情况，结果显示重组菌能够诱导小鼠产生针对上述3种保护性抗原的特异性抗体IgG。免疫攻毒保护试验表明，用大肠杆菌标准强毒株C83907（F4）、108／86（F18）和Stx 2e毒素攻毒后，重组菌诱导产生的抗体能够对小鼠提供80％以上的保护。