海兰褐鸡胚胎Brachyury cDNA的克隆与序列分析

为了扩增海兰褐鸡胚胎Brachyury基因,试验采用RT-PCR的方法,根据Gen Bank中报道的原鸡Brachyury序列设计1对特异性引物,以海兰褐鸡胚胎尾芽组织提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出海兰褐鸡胚胎Brachyury的c DNA,并克隆到p MD-19T载体中,通过菌落PCR和DNA序列测定进行最终鉴定。结果表明:所克隆的c DNA为海兰褐鸡胚胎Brachyury基因的部分序列,用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果与已发表的鸡胚胎Brachyury基因序列进行对比,1 292个碱基中仅有6个碱基有差异,同时该段c DNA包含由1 167个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码387个氨基酸残基,符合Brachyury基因特征。     

表达PRRSV E基因重组质粒在小鼠诱导的体液免疫应答

利用 PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) BJ- 4株的 E基因进行修饰和改造 ,在 E基因上游加入 Kozak序列 ,扩增并克隆 E基因。将 E基因 c DNA亚克隆至真核表达载体 pc DNA3.1( )中 ,构建了真核重组表达质粒 pc DNA- E。用pc DNA- E免疫小鼠 ,经免疫荧光抗体试验检测结果表明 ,重组质粒 pc DNA- E经 3次免疫后 ,所有小鼠血清抗体均为阳性 ,说明pc DNA- E在小鼠体内可诱导特异性的体液免疫应答反应。     

藏系绵羊KRT26基因的克隆测序和组织表达分析

为了克隆藏系绵羊KRT26基因序列,并研究其组织表达谱,试验从藏系绵羊皮肤中提取总RNA,用RT-PCR技术克隆KRT26基因,并进行了氨基酸序列测定和荧光定量PCR分析。结果表明:获得了1 407 bp的编码区序列,该序列与绵羊KRT26基因的预测序列仅有1个碱基差异,推导的氨基酸序列相同,与牛、人、小鼠KRT26的氨基酸序列相似性依次为94.44%、79.44%和73.32%。KRT26基因在藏系绵羊的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪、皮肤中均有不同程度表达,但在皮肤的表达量远远高于其他组织,表现出极高的组织特异性。     

黄颡鱼促甲状腺激素受体基因的克隆及其对饲料中添加碘化钾的表达反应

本试验旨在得到黄颡鱼促甲状腺激素受体(TSHR)基因的c DNA全长序列,同时掌握其组织表达差异,并揭示饲料中添加碘化钾对黄颡鱼甲状腺TSHR基因表达及生长性能的影响。采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆TSHR基因c DNA全长序列,再应用荧光定量PCR技术检测TSHR基因的相对表达量,并制备了碘化钾添加量分别为0(对照)、10、50和100 mg/kg的4种试验饲料进行为期27 d的黄颡鱼养殖试验。结果显示:本试验成功克隆得到长度为2 786 bp的TSHR基因c DNA的全长序列,其中开放阅读框2 238 bp,编码745个氨基酸,Blast程序分析表明黄颡鱼TSHR氨基酸序列与其他已知鱼类的相似性为60%~87%。组织表达分析结果表明TSHR基因在甲状腺组织中的相对表达量较高,其次是肝脏、肌肉和肠道。养殖试验结果表明,100 mg/kg组甲状腺TSHR基因相对表达量显著高于其他各组(P0.05),50和100 mg/kg组的增重、特定生长率和饲料系数显著优于对照组(P0.05)。由此得出,饲料中添加适量的碘化钾不仅影响TSHR基因的表达,还能有效促进黄颡鱼的生长。     

狂犬病“靶向性”中和表位DNA疫苗的构建与瞬时表达

采用RT-PCR获得BALB/c小鼠P41基因,并在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461 nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变；然后采用定向克隆方法将狂犬病病毒糖蛋白主要中和抗原表位核苷酸序列替换P41序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应以获得带有Kozak调控序列的P41-N分子,以增加目的基因的表达量,并将该含有Kozak序列的P41-N分子克隆插入到真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定；最后将各中和表位表达载体转染COS-7细胞,Western blotting检测目的基因的瞬时表达.测序分析结果显示,BALB/c小鼠P41基因CDS区为840 bp,编码279个氨基酸,与GenBank已登录(NM_010545)核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异；定点突变后获得了P41分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明成功构建了携带P41-N分子的真核表达载体；Western blotting证实各P41-N分子均在COS-7细胞获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P41多克隆抗体发生抗原抗体结合反应.结果表明,成功构建了狂犬病病毒主要中和抗原表位的“靶向性”核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础.     

鸡白细胞介素18成熟蛋白全长基因的克隆与序列测定

根据已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18)成熟蛋白的 c DNA序列 ,设计 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR从脂多糖(L PS)刺激 10 h活化的 MDCC- MSB1细胞中克隆到编码鸡 IL - 18成熟活性蛋白的完整基因片段 ,其大小为 5 10 bp。经序列测定证实 ,所获得的 c DNA基因序列与文献报道的结果完全一致 ,从而为进一步研究鸡 IL- 18的基因表达、生物学活性以及应用奠定了基础。     

人溶菌酶基因hLYZ在小鼠乳腺中的表达及其抗菌活性检测

从人胎盘组织中克隆获得人溶菌酶基因hLYZ,选用体内表达载体pcDNA3.1,构建表达载体pcDNA3.1hLYZ,并转染至小鼠体内,采集小鼠乳汁和乳腺组织,通过RT-PCR方法检测基因的表达水平,用免疫组化反应、Western blotting检测蛋白的表达,并通过体外抗菌活性检测重组人溶菌酶的抗菌活性。经酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组质粒pcDNA3.1-hLYZ构建正确,小鼠乳清的SDS-PAGE电泳显示在约14700处有特异的蛋白条带出现,Western blotting检测表明成功表达了人溶菌酶,根据回归方程计算酶活性为4011U/mL,体外抗菌活性检测结果显示重组人溶菌酶对大肠杆菌有明显裂解作用。本试验成功地在小鼠乳腺中表达了重组人溶菌酶,表达的蛋白具有较高的酶活性,这些结果为哺乳动物乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

绦虫催乳素基因cDNA克隆及序列分析

根据文献报道的脊椎动物催乳素基因 c DNA序列的保守区 ,设计 1对引物。提取绦虫总 RNA,采用 RT- PCR扩增绦虫催乳素基因 ,琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物 ,将回收产物连接到 p MD- 18T克隆载体 ,对待选克隆进行 PCR和酶切鉴定。阳性克隆进行序列测定 ,获得全长 893bp的 c DNA序列 ,共编码 2 2 2个氨基酸 ,其中前 2 2个氨基酸为信号肽 ,成熟蛋白共编码 2 0 0个氨基酸。将测序结果与 Gen Bank中已知序列比较 ,推导氨基酸序列并进行活性位点分析 ,所得序列与脊椎动物催乳素同源性最高 ,含有催乳素的 2个活性区域 ,证明所得到的序列就是催乳素序列。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒 (MPV) FM株基因组核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,分别对国内 2株番鸭细小病毒分离株 MPV扬州 (YZ)株和 MPV佛山 (FS)株主要结构蛋白 (VP2和 VP3)基因进行 PCR扩增 ,并克隆到p CR3.1T载体 ,经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较。结果表明 ,MPV YZ和 MPV FS的VP2 - VP3基因大小均为 176 4bp,编码 5 88个氨基酸。 MPV YZ、MPV FS与 MPV FM核苷酸序列同源性分别为98.5 %和 98.6 % ,氨基酸序列同源性为 97.1%和 97.8% ;MPV YZ与 MPV FS核苷酸序列的同源性为 99.5 % ,氨基酸序列同源性为 98.8%。     

甘南牦牛Lfcin基因克隆及序列分析

利用PCR技术从甘南牦牛基因组DNA中扩增获得了含乳铁蛋白素（lactoferricin,Lfcin）基因的DNA序列,将该DNA序列连接于pGEM-Teasy载体并测序,将甘南牦牛含Lfcin基因的DNA序列与奶牛相应序列进行比对,同时对牦牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。结果：试验首次克隆获得了含甘南牦牛乳铁蛋白（lactoferrin,LF）第二外显子的DNA序列（在Gen-Bank中获得登陆号EU247256）,共778 bp,其中LF基因第二外显子长165 bp,编码55个氨基酸,Lf-cin蛋白占25个氨基酸;序列分析结果显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛相应序列存在3个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同;各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性,Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律。     

用表达人溶菌酶基因的重组质粒防治干乳期奶牛乳腺炎

将人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）cDNA插入由pcDNA3改造而成的pcDNAK表达载体。用获得的重组载体pcDNAKLYZ转染COS-1细胞，经免疫荧光试验证明能进行正确表达。将重组载体注射于哺乳母鼠，取其乳汁进行溶菌酶活性测定，结果显示，分泌在乳汁中的重组hLYZ高达139mg／L。根据乳汁体细胞检测结果，选择健康奶牛和乳腺炎阳性奶牛，分别在干奶时和产犊前2周2次注射重组质粒pcDNAKLYZ，注射途径为乳腺基部穿刺，注射剂量为300μg／乳区,于产犊后1个月采集奶样进行体细胞检测，结果显示，对前一泌乳期发生的奶牛乳腺炎的治愈率为91．5％，对下一泌乳期奶牛孔腺炎的预防有效率王少为96．97％。由此认为。构建的表达hLYZ基因的重组表达质粒，可以替代抗菌素类油乳剂用于干乳期乳腺炎的防治。     

狮头鹅PRL基因的克隆及原核表达

为了进一步研究PRL对狮头鹅繁殖性能的生理调节机制,采用RT-PCR方法从狮头鹅脑垂体组织扩增获得PRL基因的cDNA序列,克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-PRL,并进行序列测定和分析。将测序正确的cDNA序列定向克隆到pET32a(+),构建表达载体pET32a-PRL,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western Blot分析。狮头鹅PRL基因编码区含有600个核苷酸,编码199个氨基酸(GenBank No.GQ856665),与其它禽类PRL具有高度保守性;狮头鹅PRL蛋白二级结构由多个α螺旋和β转角及无规卷曲构成,推测N端70～76、95～102、150～155和207～213区段为其抗原表位的优势区。SDS-PAGE检测表明狮头鹅PRL基因在大肠杆菌中获得了高效表达,可溶性表达产物约占全菌总蛋白的53.6%,融合蛋白分子量约41ku,并用镍柱亲和层析法分离纯化融合蛋白。Western Blot分析证实了所获的融合蛋白具有较强抗原性。试验结果为进一步研究PRL基因的生物功能及其对狮头鹅就巢、产蛋等生产性状的影响奠定了基础。     

蒙古绵羊Ghrelin基因的克隆和原核表达

为了克隆蒙古绵羊Ghrelin基因,构建其原核表达载体,并检测其在大肠杆菌中的表达情况.本研究用RT-PCR方法从蒙古绵羊胃组织mRNA扩增获得Ghrelin基因的cDNA序列,克隆到pMD-19T载体后进行序列分析.将测序正确的cDNA序列与原核表达载体pET-32a(+)连接,并转化BL21( DE3)大肠杆菌.经...     

奶牛LAP基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。     

西农萨能羊两个泌乳阶段差异表达基因SAA3的克隆和序列分析

为了研究不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因，利用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊泌乳60d乳腺组织及泌乳28d乳腺组织中差异表达基因文库，用Real-Time PCR技术验证阳性克隆血清淀粉样蛋白A3（SAA3）基因，通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织SAA3，并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库，筛选克隆了乳腺组织SAA3基因，GenBank登录号为：DQ839400，编码区长度为396bp，含有131个氨基酸。西农萨能羊乳腺组织中SAA3与牛（GenBank：NM_181016）、兔（GenBank：M64696．1）、人（GenBank：BC020795）、鼠（GenBank：NM_011315）核苷酸同源性分别为95％、84．3％、81.3％和81.9％，氨基酸同源性为93％、76％、72％、72％；在编码区261-287位较人、兔、鼠SAA编码区多27个碱基，连续大于5个氨基酸的保守区域有6个，较人SAA多3个潜在功能基序。     

奶牛乳房炎抗性基因TAP cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T Simple载体中,并进行序列分析。序列分析结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF) 195 bp,与牛TAP基因同源性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。     

猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究

本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础.     

亚洲璃眼蜱差异表达新基因P18的克隆和鉴定

为了进行抗蜱和蜱传病疫苗的研究,本实验对亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中获取的一个全长编码基因P18进行了研究。该基因全长519bp,共编码170个氨基酸,分子量为18.36Ku,等电点为4.28。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与肩突硬蜱、篦子硬蜱唾液腺的抗凝血小肽有30%～40%低度同源性。将该基因亚克隆到pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,重组融合蛋白以可溶性形式高效表达。将可溶性重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清。经免疫印迹分析表明,该重组蛋白抗体可特异性的识别半饱雌蜱唾液腺中的天然蛋白抗原,而未吸血雌蜱唾液腺中则不显现特异条带。RT-PCR结果进一步证实,该基因在蜱吸血后的唾液腺中差异表达。     

猪唾液酸黏附素氨基端结构域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备

本试验旨在克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体。试验中应用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-Sn150,成功表达了分子质量大小约为43.1 ku的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白pET-Sn150免疫小鼠,制备获得鼠抗pET-Sn150重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接 ELISA 和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-Sn150多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。本试验克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因并成功表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

Cloning and expression analysis of prohibitin mRNA in canine mammary tumors

Prohibitin is an antiproliferative protein that is a product of a putative tumor suppressor gene. However, there is little information on prohibitins in companion animals. In this study, we cloned canine prohibitin mRNA using RT-PCR and 3′-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). The sequence was well conserved compared with those of other mammals, including human. The deduced amino acid sequence translated from the open reading frame completely corresponded to the human sequence. Canine prohibitin mRNA was expressed in all normal mammary and tumor samples examined. These results suggest that this protein plays a vital role in cell growth mechanisms and may be related to the occurrence of canine mammary tumors.