猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3（cz）杉ORF5基因序列分析及原核表达

从河北沧州分离到1株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为H13-3（cz）株。根据GenBank公布的PRRSV CH—1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物（P1／P2）,用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒进行序列测定与分析。再设计另一对引物（P3／P4）从重组载体pGM—ORF5中扩增出缺失了N端28个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,并成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3(cz)株ORF5基因序列分析及原核表达

从河北沧州分离到1株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株.根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一对引物(P3/P4)从重组载体pGM-ORF5中扩增出缺失了N 端28个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,并成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应.为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF3基因的克隆及变异分析

从河北唐山分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为TS株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF3基因,将扩增产物连接到pMD19-T载体并转化克隆菌,将阳性重组质粒PMD-GP3进行序列测定与分析。应用DNA Star软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株的ORF3基因进行序列比较,并绘制系统进化树。这为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF5基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得5个ORF5基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果表明,5个ORF5基因序列之间核苷酸同源性为97.7%～98.5%,与欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR-2332、2006—2007年国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)、2006年以前中国分离毒株(CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh))和2个疫苗株(Resp PRRS MLV、MLV RespPRRS/Repro)核苷酸同源性分别为63.5%～64.0%、88.7%～89.2%、97.7%～99.3%、88.1%～96.7%和88.6%～89.1%;氨基酸同源性分别为56.1%～56.6%、87.8%～88.8%、96.6%～98.5%、85.9%～93.2%、86.8%～87.9%。结果表明山西地区的PRRSV流行毒株均属于美洲型,且毒株同源性很高,亲缘关系紧密。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒柳州地方株NSP2和ORF5基因变异分析

为了给广西柳州预防和控制猪繁殖与呼吸综合症提供理论数据,本研究对利用RT-PCR方法扩增了该地区流行株LZ5和LZ6的NSP2和ORF5基因并进行测序分析,然后与GenBank中已发表的PRRSV毒株的NSP2和ORF5基因序列进行比较。结果显示,2株柳州地方流行株均属于美洲型,在NSP2基因第483位和535~563位氨基酸均存在30个氨基酸的不连续缺失,其NSP2和ORF5基因的核苷酸同源性分别为99.5%和99.7%,推导的氨基酸同源性分别为100%和99.5%;与近几年国内流行的高致病性蓝耳病代表性毒株之间的NSP2、ORF5基因核苷酸同源性分别为94.7%~96.2%和97.2%~98.0%,其推导的氨基酸同源性分别为92.0%~95.5%和94.5%~97.0%。序列分析结果表明此次柳州流行的PRRSV与2006年夏高热病引起的基因序列高度同源,在基因序列上并未显示出新的特性,在国内也缺乏明显的地域性差异。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

参考Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PKRSV）ATCC VR-2332的ORF5基因序列，设计并合成了一对引物．对来自福建、浙江、山东等地的PRRSV分离毒株进行RT-PCR扩增．获得约748bp的DNA片断，将其分别克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列，并与ATCCVR-2332、CH-1a、MLV、Lv等毒株的ORF5序列进行比较，结果表明：SHDl与F114、MLV、ATCCVR-2332同源性高达98．5％，与CH-1a同源性为91．0％，与其它毒株同源性为86．6％~88．4％；F114与MLV、ATCCVR-2332同源性为99．3％～99．7％．其余分离毒株在遗传关系上和CH-1a又分为明显的两个群．显示近年来各地PRRSV分离毒株与cH-1a株的遗传差异越来越大。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

贵州省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

为了调查猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异情况,笔者收集了贵州省16家规模化养殖场153份疑似PRRS的样品,通过RT-PCR检测和ORF5基因序列的测定,结果表明:所有样品之间ORF5基因的同源性为98.7%～100%,氨基酸的同源性为98.5%～100%;与美洲型代表毒株VR-2332、国内标准毒株CH-1a和欧洲型代表毒株LV基因序列的同源性分别为89.2%～90%、94.8%～95.6%、59.7%～60.2%,氨基酸序列同源性分别为88.8%～89.3%、92.7%～94.2%、54.9%～55.3%,遗传衍化关系分析表明流行毒株属于美洲型.ORF5基因发生离散性变异,可以分为3个簇,与中国其他地区分离的高致病性PRRS病毒关系密切,而与早期分离的PRRS毒株关系疏远,说明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因存在变异现象.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。     

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株（HP-PRRSV）;3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株（HP-PRRSV）为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南分离株ORF5基因的遗传进化分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在湖南省地方猪保种场的感染情况,本研究在2019－2020年间从湖南省2个地方猪保种场采集287份全血样品。首先将血样混合成41份,采用RT-PCR或PCR法进行PRRSV病原检测,进一步通过高保真PCR扩增从PRRSV阳性样品中扩增PRRSV ORF5基因;测序后利用DNAStar软件分析获得的ORF5基因及其编码的GP5氨基酸与国内外不同PRRSV毒株的遗传进化关系;最后用PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞,经盲传分离毒株,并用Reed-Muench法测定病毒滴度。结果显示,检测的41份混样中有3份PRRSV病原核酸呈阳性;从PRRSV阳性混样中单独扩增获得6条PRRSV ORF5基因序列,均属于PRRSV-2型的lineage 8分支,相似性为99.2%~99.8%;6条ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在信号肽区域（第23位）、潜在的N-糖基化位点（第33位）和表位C （第59位）存在差异;PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞盲传5代后出现明显的细胞病变,获得1株PRRSV毒株,命名为NX-1,病毒TCID₅₀为4×10⁵/mL。本研究表明,湖南省地方猪保种场存在PRRSV感染,感染的PRRSV属于PRRSV-2型的lineage 8,其GP5氨基酸序列存在的多处变异可能是造成疫苗免疫失败的原因之一,以上结果可为湖南省地方猪保种场的免疫防控提供一定参考。     

精液和流产胎儿猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因的序列分析

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)是一种单股正链RNA病毒,其基因组包括8个开放阅读框(ORF),其中变异最大的是ORF5基因,它的变异可以在一定程度上反映PRRSV的变异情况[1~3],因而ORF5基因可作为分子流行病学调查的对象。本试验通过RT-PCR检测广西某猪场的公猪精液和流产胎儿有PRRSV的存在。PRRSV在猪体内持续感染过程中,会有准种或病毒亚群的出现[4],但是,PRRSV通过精液的传播是否也出现类似情况,目前尚未见有报道。因此,我们对精液与流产胎儿的PRRSV的ORF5基因进行了扩增、克隆和序列分析,并比较精液和流产胎儿PRRSV…     

2016年-2017年广东省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为研究广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株ORF5基因的遗传演化情况,采用RT-PCR方法对2016年-2017年采自广东省地区猪场疑似PRRS猪肺脏组织样品中的PRRSV ORF5基因进行了扩增,并对这些毒株的核苷酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析.结果表明,成功扩增出12株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段.遗传演化分析表明,扩增出的毒株有10株与国内高致病性毒株亲缘关系较近,属于同一分支;2株与广东地区新报道的毒株QYYZ和GM2亲缘关系较近,属于同一分支.氨基酸序列比对结果表明,新分离的毒株在GP5抗原表位上存在广泛的变异.结果表明,该地区PRRSV毒株已经发生广泛变异.研究结果不仅揭示了广东地区流行的PRRSV ORF5基因的遗传演化特性,也为该地区PRRS的防控提供了科学依据.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析

采用RT-PCR方法对不同省份疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序,获得14个ORF5基因片段.序列分析结果表明,获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%.与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%、86.6%～88.6%、85.6%～87.6%、54.7%～56.2%之间.表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型.进一步分析发现与近期国内流行的高致病性猪蓝耳病病毒同源性非常之高,说明这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪的运输流通等在全国流行.     

8株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

本研究拟初步了解中原地区近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况。对2011—2012年间从河南及周边省份发病猪场分离的8株PRRSV毒株Nsp2基因变异区进行RT-PCR扩增,同时对主要结构蛋白GP5基因进行克隆测序并与GenBank中登录的中国历年来流行的PRRSV代表毒株的GP5蛋白序列进行遗传进化分析,对主要氨基酸基序进行比对分析。结果表明,2011—2012年在中原地区分离的8株PRRSV分离株均为Nsp2缺失变异株,GP5基因与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同源性较高。     

2018年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因变异分析

为了解广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株ORF5基因遗传变异情况,采用RT-PCR对2018年采自广东部分地区疑似患有PRRS的猪肺组织样品进行PRRSV ORF5基因扩增以及克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明,成功扩增出18株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段。ORF5基因序列分析表明,18株PRRSV流行毒株ORF5基因核苷酸同源性为83.7%~99.8%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性为62.1%~99.8%。基于ORF5基因的遗传进化树分析表明,18株PRRSV流行株均为美洲型毒株。其中,10株与以JXA1为代表的高致病性毒株亲缘较近,2株与新型高致病性毒株FZ16A相似;1株与以NT1为代表的疫苗返强毒株亲缘较近,1株与以R98为代表的疫苗毒株亲缘性较近,4株与广东新报道的GM2和QYYZ毒株亲缘性较近。DNA推导氨基酸序列分析表明,18株流行株的氨基酸序列与国内已报道的代表株相比发生不同程度的变异,GP5抗原表位上存在着差异。研究结果揭示了广东地区PRRSV有新型强毒株、重组毒株以及疫苗返强毒株的流行,提示养殖者谨慎、合理使用疫苗,防止疫苗毒株返强和毒株重组,为该地区防控PRRS提供参考。     

PRRSV河北地方分离株ORF5基因序列分析

为了分析河北秦皇岛和唐山部分地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因变异情况,对采集自秦唐部分地区在2009年的临床发病猪肺组织,提取其RNA,通过RT-PCR扩增样本中PRRSV的ORF5全序列,并对其进行生物信息学分析.应用DNA Star软件分析序列,系统进化分析表明,它们与国内2006年-20...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。     

2018年四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的分子流行病学调查研究

为研究四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行及进化趋势,本研究以GP5蛋白为研究对象,对2018年间收集的378份四川省不同区市县PRRSV疑似病料进行了实时荧光定量PCR检测,并对部分毒株ORF5基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行进化分析和N-糖基化位点预测。通过疑似病料实时荧光定量PCR检测,共检出阳性样品69份,阳性率为18.25%。对其中23株PRRSV的ORF5基因序列分析结果显示,ORF5基因之间核苷酸同源性为81.6%~100%,推导的氨基酸同源性为81.4%~100%,均属于美洲型毒株。其中,1株属于以经典毒株VR2332为代表的亚型Ⅰ,17株属于以高致病毒株JXA1为代表的亚型Ⅱ,5株属于重组毒株NADC30为代表的亚型Ⅲ,说明2018年间四川省PRRSV流行毒株存在基因多样性,HP-PRRSV依然是主要流行毒株,但仍存在不断进化的经典毒株,同时,类似NADC30和QYYZ的重组毒株也开始出现。通过氨基酸突变位点和N-糖基化位点分析发现,23株PRRSV在GP5两个重要抗原表位相关区域和毒力相关位点均发生了一定程度的突变,推测这些突变可能影响了病毒逃避机体免疫和病毒毒力,提示在PRRSV防控中,应该加强遗传进化分析,根据不同类型的毒株选择有针对性的疫苗和防控策略。