体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]分离和克隆小鼠骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经元样细胞。[方法]利用Percoll密度梯度离心的方法进行小鼠骨髓间充质干细胞分离及培养,分别采用β-巯基乙醇和BHA诱导分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学方法对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。[结果]经2种诱导剂诱导的小鼠骨髓间充质干细胞均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支。而且免疫细胞化学鉴定显示,诱导分化后的神经元样细胞神经元特异性烯醇化酶染色和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学染色均呈阳性,β-巯基乙醇诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（86.8±2.7）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（75.2±2.3）%;BHA诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（80.5±2.2）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（73.2±1.6）%。[结论]小鼠骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和BNA的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

仔猪神经干细胞体外培养及鉴定

由仔猪脑部海马体齿状回分离得到神经干细胞,利用无血清培养基添加特定生长因子方式培养;采用RT-PCR鉴定神经干细胞和诱导分化后细胞生物特性;利用免疫荧光化学技术检测克隆的细胞抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原表达。由海马体齿状回分离的细胞群具有连续克隆能力;根据免疫荧光检测,脑神经干细胞表达巢蛋白、配对盒因子6和解整合素样金属蛋白酶10;体外培养下NSCs可被诱导分化为神经源性细胞,且表达微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白。分离和培育NSCs细胞结果显示,其具有更新能力和分化为神经元和胶质细胞的潜能,可为干细胞移植提供基础数据。     

愈痫灵方对PTZ致痫鼠认知功能障碍与海马p-CREB、CaMK IV表达的影响

目的 分析愈痫灵方对海马磷酸化环磷腺苷应答元件结合蛋白（CREB）、钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（CaMK IV）的关系和表达变化,探讨愈痫灵方改善戊四氮（PTZ）致痫鼠认知功能障碍的影响。方法 取健康雄性SD大鼠120只,从中随机选取10只作为正常对照组,其余大鼠用戊四氮造模,将符合模型标准的大鼠随机抽取60只分为愈痫灵组、拉莫三嗪组、丙戊酸钠组和模型组,每组15只。灌胃后用水迷宫实验测试大鼠的学习记忆能力,采用免疫组织化学方法检测p-CREB、CaMK IV在海马体CA1区的表达变化。结果 各组大鼠水迷宫实验潜伏期和总路程的学习记忆成绩比较有显著统计学意义（P<0.001）：模型组与正常组比较,差异有显著统计学意义（P<0.001）;拉莫三嗪组、愈痫灵组与模型组比较,差异有显著统计学意义(P<0.001)。愈痫灵方对致痫鼠海马CA1区P-CREB、CaMK IV表达的影响：各组之间表达的比较,差异有显著统计学意义（P<0.01）;模型组与正常组比较,差异有显著统计学意义（P<0.01）;愈痫灵组、拉莫三嗪组与模型组比较,差异有显著统计学意义（P<0.01）。结论 愈痫灵方可以通过增强海马区p-CREB的水平,提高P-CREB的上游通路CaMK IV,改善致痫大鼠的学习记忆能力。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及向神经细胞诱导分化的研究

采用体外细胞培养技术将山羊胎儿骨髓中的干细胞从骨髓血中分离并培养扩增;分别用含β-巯基乙醇或当归的培养液诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,免疫组织化学鉴定神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达.结果表明,通过贴壁培养法,可使低丰度的山羊骨髓间充质干细胞在体外实现分离扩增;诱导后的细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶.还建立了一种简单易行的体外分离与培养山羊骨髓间充质干细胞的方法,同时表明山羊骨髓间充质干细胞同样具有分化为神经细胞的潜能,为今后对某些疾病的治疗提供了理想的动物模型.     

小鼠MSCs体外定向诱导分化神经及脂肪细胞的研究

 【目的】建立昆明小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养体系,并鉴定其定向诱导分化为神经及脂肪细胞的能力。【方法】采用贴壁培养法分离培养昆明小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过相差倒置显微镜对其进行形态学特征观察;通过碱性磷酸酶（AKP）染色、Hoechst 33258染色、瑞士-姬姆萨复合染色检测MSCs的表型特征;通过β-ME诱导MSCs定向分化为神经样细胞,诱导后的细胞进行H.E染色,观察其形态学特性;通过NF-200、NSE免疫荧光细胞化学方法对已分化的神经样细胞进行鉴定和分化率分析;通过马血清诱导MSCs定向分化为脂肪细胞,观察其体外生长过程,并对诱导后的脂肪细胞进行油红O染色鉴定和分化率分析。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,可见多个核仁,AKP染色阳性率为93.2%±1.5%;β-ME诱导后,MSCs分化为多种表型的神经细胞与原代培养的小鼠全脑细胞的外形相似,诱导后的神经细胞NF-200、NSE免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,NF-200阳性率为85.4%±1.8%,NSE阳性率为82.7%±2.1 %;马血清诱导后,MSCs可100%分化为脂肪细胞,油红O染色为阳性。【结论】 采用贴壁培养法能够成功分离和培养昆明小鼠的MSCs,分离得到的MSCs具有定向分化成多种神经细胞和脂肪细胞的能力。     

奶山羊骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

【目的】分离、培养奶山羊骨髓间质干细胞(MSCs),探讨其生物学特性,为心血管、神经退化,尤其是不育症患者的细胞移植治疗及相关细胞发育分化研究奠定基础。【方法】采用贴壁培养法进行MSCs的分离和培养,通过形态学观察、生长曲线测定、免疫细胞化学染色和RT-PCR技术等进行检测;并采用免疫细胞化学法对自发分化的细胞及定向诱导分化的神经样细胞、心肌样细胞、生殖样细胞进行检测,计算生殖样细胞的阳性率。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,其增殖能力强,无致瘤性,已连续传代至22代;其表达胚胎干细胞(ESCs)的表面标记Oct4、Nanog、C-myc和TERT;MSCs形成类胚体自发分化的细胞表达3胚层特异标志基因AFP、β-ⅢTubulin和心肌α-actin;MSCs经β-巯基乙醇诱导,定向分化为表达Nestin和β-ⅢTubulin的早期神经样细胞,经5-氮胞苷(5-Aza)诱导,可定向分化为表达CT3及心肌α-actin的心肌样细胞,并出现肌管样结构,经维甲酸(RA)诱导,分化的细胞表达生殖细胞减数分裂前期的蛋白Vasa、Scp3和CD49f(α6整合素)等生殖细胞标记,其阳性率分别达到35.7%,24.0%和14.0%。【结论】自奶山羊骨髓分离得到MSCs,其具备间质干细胞的基本特性,并具有向神经细胞、心肌细胞、生殖细胞分化的潜能。     

Ca~(2+)信号介导川芎嗪诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的定向分化

用含2.4 mg.mL-1川芎嗪提取液对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行诱导,探讨川芎嗪体外诱导BMSCs分化为神经元样细胞的作用.应用EGTA(细胞外Ca2+螯合剂)、Nifedipine(L-型Ca2+通道阻断剂)和LY294002(PI3K阻断剂)等Ca2+阻断剂分别作用细胞,RT-PCR和Western blot技术研究Ca2+信号在川芎嗪诱导BMSCs分化为神经细胞过程中的作用.结果表明:川芎嗪作用不同时间的BMSCs均可见Nestin、β-Tubulin Ⅲ、NSE和Nurrl的表达;川芎嗪诱导后的细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达呈阳性.EGTA、Nifedipine及LY294002分别阻断细胞外Ca2+、L-型Ca2+通道及PI3K后,NSE和Nurr1基因及NSE蛋白表达较川芎嗪诱导组显著上调.以上结果说明川芎嗪能使BMSCs定向分化为神经元样细胞,细胞内、外Ca2+的减少可促进川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞的分化,Ca2+信号在川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞定向分化过程中起负调控作用.     

大鼠骨髓基质细胞培养的实验研究

目的探讨利用骨髓基质细胞体外培养获得神经干细胞的方法及应用．方法体外培养大鼠骨髓基质细胞;免疫组化检测;流式细胞仪检测．结果加BME的骨髓基质细胞大量分裂,形成大量的细胞分裂球,传到4代时,90％以上的细胞表达Nestin阳性．结论BME对骨髓基质细胞有明显的促分裂作用,应用此种方法可获得神经干细胞（Neural stem cell,NSC）．     

β淀粉样蛋白(25-35)对AD大鼠海马Beclin-1表达及学习记忆的影响

研究β淀粉样蛋白(25-35)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1的表达和学习记忆功能的影响。通过行为学以及免疫组织化学检测,观察模型大鼠学习记忆功能以及海马Beclin-1表达的变化。行为学检测表明:模型组的学习记忆功能明显低于正常组,模型组Beclin-1表达明显降低(P<0.01)。海马CA1区注射β淀粉样蛋白(25-35)大鼠学习记忆力下降,Beclin-1表达下调,提示Beclin-1蛋白的表达降低很可能是β淀粉样蛋白(25-35)致神经元可塑性降低的关键环节。     

Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells

Normal intestinal mucosa contains abundant immunoglobulin A (IgA)-secreting cells, which are generated from B cells in gut-associated lymphoid tissues (GALT). We show that dendritic cells (DC) from GALT induce T cell-independent expression of IgA and gut-homing receptors on B cells. GALT-DC-derived retinoic acid (RA) alone conferred gut tropism but could not promote IgA secretion. However, RA potently synergized with GALT-DC-derived interleukin-6 (IL-6) or IL-5 to induce IgA secretion. Consequently, mice deficient in the RA precursor vitamin A lacked IgA-secreting cells in the small intestine. Thus, GALT-DC shape mucosal immunity by modulating B cell migration and effector activity through synergistically acting mediators.     

胚胎干细胞的分离克隆

从全能性或多能性细胞获取、分化抑制物选择、培养基、分离方法、鉴定、保存等６个方面，对胚胎干细胞的分离培养体系的建立进行了系统综述。     

Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells

Neural stem cells are reported to lie in a vascular niche, but there is no direct evidence for a functional relationship between the stem cells and blood vessel component cells. We show that endothelial cells but not vascular smooth muscle cells release soluble factors that stimulate the self-renewal of neural stem cells, inhibit their differentiation, and enhance their neuron production. Both embryonic and adult neural stem cells respond, allowing extensive production of both projection neuron and interneuron types in vitro. Endothelial coculture stimulates neuroepithelial cell contact, activating Notch and Hes 1 to promote self-renewal. These findings identify endothelial cells as a critical component of the neural stem cell niche.