分子靶标烟草花叶病毒外壳蛋白的结构生物学研究进展

病毒外壳蛋白(CP)是烟草花叶病毒(TMV)基因结构的重要组成部分,其主要功能除保护核酸物质不被降解外,还与TMV的远距离移动及寄主症状有关。目前研究较多的是CP基因介导的抗性、药剂干扰CP的聚合等,而有关靶标CP与药剂的作用机理尚未有系统全面的报道。从结构生物学的角度出发,详细介绍了TMV CP在电镜及单晶衍射技术下的三维结构;比较了国内已报道的CP的基因序列;综述了CP在基因工程领域的应用及其受药剂分子的干扰作用等方面的研究进展。以毒氟磷药剂为例,分析了其可能作用于TMV CP的分子机理,预测了毒氟磷小分子与TMV CP大分子可能的作用位点。有助于进一步研究和发现新型抗TMV药剂。     

15种植物的单宁提取物对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用

 测定了15种植物的乙醇粗提物对TMV的体外抑制作用,其中11种具有明显效果,这11种植物粗提物经水/氯仿萃取,水萃取物具有明显抑制TMV效果,而氯仿萃取物抑制效果差。水萃取物用明胶去除单宁后,基本失去抑制TMV的能力,表明单宁在其中起着重要作用。从杠板归与假槟榔种子中提取的总单宁对TMV具有明显的抑制作用;病毒粒体样品在分别加入这2种植物总单宁后,电镜下表现为聚集结合;TMV分别与这2种植物的单宁混合后,通过透析,可恢复大部分侵染力,表明单宁对病毒并无直接毒害作用;TMV外壳蛋白(CP)与单宁混合后,在蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为结合现象;单宁对TMV体内抑制复制效果不明显;单宁在接种TMV前后施用并没有降低TMV侵染力;这些结果表明这2种植物单宁对TMV抑制作用可能是与TMV-CP结合而引起病毒侵染力下降或影响病毒CP对侵染位点的识别。     

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

 从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒,接种6科31种鉴别寄主,能侵染5科22种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片,用0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)匀浆后汁液加4% PEG-8000沉淀3h,5%~40%甘油梯度离心纯化病毒,可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒,长度740nm左右。病毒提纯液于264nm处有一吸收峰,为典型的核蛋白紫外吸收。TuMV-H分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的PCR引物扩增其外壳蛋白基因,可得-0.9Kb的片段。     

烟草品种对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的抗性鉴定

 2010-2011年采用大田人工接种鉴定的方法,对生产中大面积推广使用的24份烟草品种进行了烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性鉴定。结果表明,供试品种对TMV和CMV的抗病性存在较大差异,对TMV表现抗病的有Coker86、吉烟5号、Coker176、CV87、辽烟8号、CV91、中烟90等7份材料;表现中抗的有秦烟98、双抗70、C151等3份材料;表现中感的有秦烟96、G80、金星6007、龙江981、K326、秦烟201、NC89等7份材料;表现感病的有G28、云烟97、净叶黄、红花大金元、RG11、云烟85、云烟87等7份材料。对CMV表现抗病的有Coker86、龙江981、C151、秦烟201、云烟87等5份材料;表现中抗的材料是金星6007;表现中感的有CV91、RG11、Coker176、中烟90、K326、红花大金元、净叶黄、G80、G28等9份材料;表现感病的有秦烟98、云烟85、秦烟96、NC89、双抗70、云烟97、CV87、辽烟8号、吉烟5号等9份材料。其中兼抗TMV和CMV两种病毒病的材料有2份,分别是Coker86和C151。同时研究还发现,抗病性不同的烟草品种在受到病毒危害以后,对烟叶的产量和品质的影响也不同。明确了中国24个烟草品种的抗病性水平,为抗病品种的利用与品种合理布局提供科学依据,同时为烟草抗病毒病育种的亲本选择提供抗源信息。     

海带多糖对烟草花叶病毒的抑制作用及其对烟草酶活性的影响

为明确海带多糖抗病毒剂对烟草抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）病的诱导抗性及其对TMV感染后的保护作用,采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）研究0.5 mg/mL海带多糖水剂、0.5 mg/mL香菇多糖水剂、6.25 mg/L氨基寡糖素水剂和0.1 mg/mL盐酸吗啉胍.铜可湿性粉剂对TMV侵染的预防保护作用和对TMV感染植株的治疗作用,并检测施用海带多糖后烟草体内过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化和海带多糖对感染TMV后烟草叶绿素含量的影响。接种前喷施0.5 mg/mL海带多糖后,再接种TMV病毒,其抑制率可达42.42%,与喷施6.25 mg/L氨基寡糖素抑制率44.96%的效果相当,预防保护作用较好;但两种药剂处理感病植株的治疗效果较差,其抑制率仅分别为38.93%和40.13%。海带多糖能够系统地诱导烟草体内POD、PAL及SOD活性,从而控制了感染TMV后烟草叶绿素含量下降。说明海带多糖可诱导植物产生抗病性。     

植物源病毒抑制剂VFB对烟草抗烟草花叶病毒的诱导作用研究

为揭示植物源病毒抑制剂VFB的抗病毒机理,本研究以普通烟和烟草花叶病毒(TMV)为材料,测定了VFB进行预防和治疗处理后烟草中与抗病性相关的部分生理生化指标变化。结果表明:VFB可明显抑制病毒侵染后导致的细胞膜通透性增大;SOD、CAT、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶等细胞防御酶活性增强,且预防处理的效果优于治疗处理;与抗病性呈正相关的脯氨酸和总游离氨基酸的含量有显著的提高。表明VFB可诱导植物产生抗病性,增强烟草对TMV侵染的抵抗能力。     

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物, 通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3'端约1.7 kb片段, 序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b (+)上, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体, ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明, 获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应, 可用于TVBMV的快速检测。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒山西西瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

通过病毒dsRNA分离技术、非序列依赖性PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)技术和RTPCR等手段对采自山西太谷的西瓜病样进行了检测与鉴定,确定其为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)所侵染。为明确CGMMV西瓜分离物(CGMMV-SXTG)的分类地位,本研究进一步克隆了CGMMV-SXTG的外壳蛋白基因(coat protein,CP)全序列并进行序列分析,系统进化树分析显示该分离物与亚洲分离物亲缘关系较近,而与欧洲分离物亲缘关系较远,表明该病毒的不同分离物在分组上可能与地域有一定的关系;接着对不同分离物的CP基因核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比对分析,结果表明该分离物与中国山东分离物(TANG)同源性最高,分别达到99.8%和99.6%。     

接种烟草花叶病毒后不同抗性番茄品系叶片可溶性蛋白组成的变化

 用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析了不同抗性番茄等基因系GCR-267和GCR-267的叶片可溶性蛋白组成在接种TMV番茄O株后的变化。实验发现敏感品系GCR-26的叶片可溶性蛋白的组成,与健株相比较,TMV侵染株发生显著的变化。接种后7天,除一部分蛋白质含量减少外,还有四种为健株及抗性品系TMV接种株所没有的新蛋白质产生,它们在10%凝胶上的迁移率分别为Rf0.31、0.33、0.39和0.45,其中Rf0.38和Rf0.39两种蛋白质含量极大。接种后10天Rf0.31和Rf0.45两带趋于消失,但Rf0.33和0.39两带继续积累。经电泳和免疫双扩散试验证明Rf0.33蛋白带是TMV外壳蛋白:Rf0.39蛋白带与TMV外壳蛋白无关。该蛋白也不具有过氧化物酶,多酚氧化酶、酸性磷酸酶、酯酶、苹果酸脱氧酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶的催化活性,分子中不含有糖类物质。SDS-PAGE测定其分子量为14,200道尔顿。
抗性品系GCR-267的TMV接种株的叶片可溶性蛋白组成未出现象感病品系GCR-26那样的变化。
讨论了这种变化与番茄抗、感病性之间的关系。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麦花叶病毒科Bromoviridae黄瓜花叶病毒属Cucumovirus的典型种。该病毒寄主范围广泛，能侵染85科365属1000多种植物。CMV除能单独侵染寄主植物外，还经常与TMV、PVY等复合侵染，给病害的田间调查和防治造成了困难。作者从山东青州的发病烟草植株上分离到了一个CMV青州分离物（命名为CMV-QZ），利用RT-PCR的方法克隆到了其外壳蛋白（coat protein，CP）基因，利用原核表达的CMV CP制备了抗血清，以期为CMV的准确快速检测提供依据。     

嘧肽霉素对烟草花叶病毒抑制作用研究

嘧肽霉素和烟草花叶病毒(TMV)等体积混合后接种,对心叶烟的枯斑抑制率为96.5%,对系统寄主NC89的防效为84.9%。在接种病毒前24 h喷施药剂,枯斑抑制率和对系统寄主的防效分别为75.4%和69.5%。接种病毒后24 h喷药试验表明,药剂能在一定程度上抑制进入植株体内病毒的增殖。药剂与病毒混合处理后电镜观察,病毒粒子有断裂现象,混合时间越长,破坏作用越强。嘧肽霉素对TMV具有较强的体外钝化作用,且是不可逆的。     

沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对烟草花叶病毒的系统抗性诱导及互作蛋白筛选

本文研究了蛋白Rhp-PSP诱导烟草抗TMV过程中相关防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量的变化,同时测定了抗病相关基因的表达情况。试验证明,蛋白Rhp-PSP处理烟草后,叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性显著提高,但降低了MDA含量。同时基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2表达显著上调,证明了蛋白Rhp-PSP具有诱导烟草产生抗TMV的活性。为阐明诱导抗性机制,利用酵母双杂交系统从烟草cDNA文库进行互作蛋白的筛选并验证,结果表明GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白及叶绿素结合蛋白A与蛋白Rhp-PSP互作。     

葡聚六糖诱导烟草抗花叶病毒病的研究

分别采用酶联免疫吸附技术(Fab’)2-ELISA和温室盆栽试验测定了葡聚六糖诱导烟草对花叶病毒病的抗性,结果表明,葡聚六糖诱导烟草抗花叶病毒病的最佳有效浓度为10 μg/mL,最佳诱导间隔期为7 d,持效期约为28 d,诱导抗病的防病效果与诱导次数呈正比。     

壳寡糖对烟草花叶病毒的抑制作用及其对烟草酶活性的影响

以壳寡糖喷施处理感染烟草花叶病毒的心叶烟和普通烟NC89,结果表明壳寡糖对烟草具有一定的体外保护作用。利用浓度为40μg/ml壳寡糖对烟草进行处理,以接种烟草花叶病毒前10d喷施的处理效果最好,对心叶烟的枯斑抑制率为78.0%;对普通烟NC89的防治效果为32.4%,均与药剂对照好普相当。而在病毒侵染植株的前4d内喷洒,对植株几乎没有防护作用。以壳寡糖处理烟叶,可提高其叶片中苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶4种防御酶的活性,以及可溶性蛋白的含量。     

trans-Dominant Inhibition of Geminiviral DNA Replication by Bean Golden Mosaic Geminivirus rep Gene Mutants

ABSTRACT Geminiviruses are a group of single-stranded DNA viruses that cause major losses on a number of important crops throughout the world. Bean golden mosaic virus (BGMV) is a typical bipartite, whitefly-transmitted geminivirus that causes a severe disease on beans (Phaseolus vulgaris) in the Western Hemisphere. The lack of natural resistance to geminiviruses has led to attempts to engineer resistance, particularly through the use of pathogen-derived resistance strategies. The rep gene contains several conserved domains including nucleoside triphosphate (NTP)-binding and DNA-nicking domains and is the only geminiviral gene necessary for replication. Previous analysis by our group and others has demonstrated that the NTP-binding and DNA-nicking domains are necessary for geminiviral DNA replication. The ability of the rep gene and rep gene mutants to interfere with geminiviral DNA replication, when expressed in trans, was examined using a transient assay in a tobacco suspension cell culture system. Wild-type (wt) and mutant rep genes were cloned into plasmids under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter for in planta expression and coinoculated into tobacco cells with infectious clones of various geminiviruses. The wt rep gene from BGMV-GA was able to support replication of BGMV-GA DNA-B. Several different rep gene mutants, with function-abolishing mutations in the NTP-binding or DNA-nicking domains, were potent trans-dominant inhibitors of geminiviral DNA replication.     

114种植物提取物诱导烟草抗烟草花叶病毒活性鉴定

本研究以烟草和TMV为供试对象,评价了114种植物提取物诱导烟草抗TMV的活性,同时测试了这些植物提取物对TMV的钝化活性和抑制病毒粒子增殖的活性。结果表明,山苍子、平姜、苦参、八角、白屈菜、余甘子和五倍子共7种植物提取物对烟草具有显著的诱抗活性,对TMV的诱抗效果分别为78.90%、67.23%、66.82%、58.87%、53.92%、51.56%和51.28%,具有作为激发子诱导烟草抗病毒活性的应用潜力。本研究结果为开发植物源免疫诱抗剂生物农药提供了依据。