甲基对硫磷降解菌DLLBR在青菜及根际土壤中的定殖研究

将 GFP 基因标记的甲基对硫磷降解菌 DLLBR 接入 100 ml LB 培养基,过夜培养达到 1010cfu/ml,浇灌到盆钵试验的 800 g 土壤中,20 天后用激光共聚焦显微镜检测其在小青菜植株根部和植株内的定殖及分布。结果表明标记菌株能够在植株根圈较好地定殖,也能在植株内定殖。30 天后将植株各段研磨破碎,涂布 LB 平板计数发光菌落数,在根内的定殖数为 104cfu/g 根,在茎内的定殖数为 102cfu/g 茎。结果还发现与不接菌的对照相比,处理促进了植株内细菌群落结构的变化,尤其是芽孢杆菌的种类和数量明显增加。接菌 45 天后通过土壤计数检测发现,标记菌株在土壤中的存活力很高,能达到 106cfu/g 土,同时也发现与对照相比,接菌的土壤细菌群落结构明显发生了变化,细菌种类变化不大,但芽孢杆菌的数量明显增加。     

连续施用生物有机肥对烟草青枯病的防治效果

分离获得一株对烟草青枯病病原菌茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum,简称RS)具有较强拮抗能力的拮抗菌(SQR11)并制成生物有机肥,研究了连续施用该生物有机肥对烟草青枯病的防治效果。结合生理生化和16SrDNA技术鉴定,菌株SQR11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。施用该生物有机肥后第一季烟草青枯病的生物防治率达到47%以上,第二季为69%以上,第三季达到89%以上。第三批盆栽实验表明,当根际土中病原菌数量达到2×105cfu/g干土时,植株出现发病症状,随着病原菌数量的增加,发病症状加重。当根际土中拮抗菌活菌数量达到2×107cfu/g干土时,病原菌繁殖得到有效抑制,可有效阻止植株染病;若低于107cfu/g干土,则不能有效抑制病原菌增殖,植株表现发病症状。植株各组织内拮抗菌数量检测发现,未发病植株茎部拮抗细菌数量为4×104cfu/g(组织鲜重,下同)左右,而同处理中发病症状的植株茎部拮抗细菌数量仅为6×103cfu/g;相对应的病原菌数量分别为1.5×102cfu/g(健康植株)和3×103cfu/g(发病植株)。SQR11菌株制成的生物有机肥还具有较好的促生作用。总之,利用拮抗菌SQR11菌株制成的生物有机肥对烟草青枯病具有显著的生物防治作用,在根部进行大量定殖后可有效防止病原菌的侵入,能够获得显著的生防效果。     

烤烟根际土壤微生物对根系酚酸类物质的响应

【目的】烟草连作导致化感物质累积,探索化感物质中主要的酚酸类物质对根际土壤微生物的影响,可为克服烟草连作障碍提供理论依据。【方法】采用盆栽试验方法,将前期分离、鉴定出的烟草根系分泌物中主要酚酸类物质苯甲酸和3-苯丙酸接种到土壤中,模拟烟草多年连作土壤。试验设4个处理:对照(T0),向土壤中加入等量灭菌去离子水;添加苯甲酸3μg/kg土(T1);3-苯丙酸8μg/kg土(T2);同时添加苯甲酸3μg/kg土和3-苯丙酸8μg/kg土(T3),每处理5次重复。以MiSeq测序平台对根际土壤微生物进行高通量测序,探索其对根际土壤微生物的影响,同时采用荧光定量PCR法检测土壤中的茄科劳尔氏菌、短短芽孢杆菌、固氮菌、无机磷细菌、硅酸盐细菌等功能微生物及细菌和真菌的数量变化。【结果】T 1、 T 2处理土壤细菌OTUs(Operational Taxonomic Units)数目分别比对照T0降低了21.5%和17.0%,T3处理OTU数量低于T1和T2处理;T2处理土壤中优势微生物种群增多,结构平衡性降低,门上分类构成和微生物群落构成显著不同于对照。主成分分析与聚类分析显示,T2或T3处理土壤微生物聚类关系较近,都与T0处理较远;T3处理土壤中病原菌数量显著提高,拮抗菌、固氮菌、无机磷细菌、硅酸盐细菌、细菌和真菌数量显著减少,且减少幅度大于T1、T2处理。【结论】根系分泌物中主要酚酸类物质苯甲酸和3-苯丙酸均能明显改变根际土壤微生物区系,降低土壤微生群落多样性,显著增加有害微生物数量的同时大大降低有益微生物数量。两种酚类同时存在的危害效果远大于单一酚类。     

土壤中双氰胺降解及与降解菌的关系

采用灭菌土培、非灭菌土培、田间蔬菜种植、添加外源降解菌土培试验研究了土壤中双氰胺（DCD）降解及与降解菌的关系。结果显示,不论是单施DCD、尿素配施DCD,还是碳酸氢铵配施DCD的土壤,灭菌处理的土壤中DCD半衰期分别比不灭菌处理的长13.56、5.79、14.51d。降解菌生长期间,降解菌总量（x）与DCD降解呈显著正相关,拟合的线性方程为y=3.1841x-2.5452,r=0.9752。外源DCD降解真菌可在灭菌土壤中定殖并有效降解DCD,培养15d后,U＋DCD＋DCD降解菌处理土壤中DCD降解真菌的数量增加至36.40×105cfu,且DCD含量极显著降低。这些结果表明土壤中DCD降解与降解菌关系极为密切,添加外源真菌加速了土壤中DCD降解。     

短小芽孢杆菌BX-4抗生素标记及定殖效果研究

为研究短小芽孢杆菌BX-4在作物根际的定殖及防病效果,通过浓度梯度法用氨苄青霉素对其进行了抗性标记,并通过番茄盆栽试验研究了其在根际土壤中的定殖规律。结果表明,筛选出的突变体菌株BX-4＇能够耐受浓度为200 μg·mL^-1的氨苄青霉素,并且具有耐药和遗传双重稳定性;应用试验显示该突变体菌株能成功在番茄根际定殖,接种20 d后根际土壤中存活数量达到最高值1.34×10^8 cfu·g^-1干土,以后逐渐下降,到50 d时趋于稳定;筛选的突变体菌株对番茄青枯病具有明显的防治效果,防效达37.9%-50.9%。短小芽孢杆菌BX-4在作物根部的定殖规律为揭示其生防机理及应用该菌提供了科学根据。     

一株抗药用白菊枯萎病生防菌的分离与生防效应研究

从生长健康的药菊根际土壤分离筛选获得一株对其连作土传枯萎病致病菌（尖孢镰刀菌菊专化型）具有较强拮抗作用的细菌a4,并通过盆钵和田间小区试验研究其生防效果。结果表明,拮抗菌a4对药菊枯萎病病原菌的抑制率达71%。盆栽试验,施用a4二次发酵的生物有机肥（CK+BOF1）,未发生药菊枯萎病,而对照植株则完全发病;对照植株根际土壤尖孢镰刀菌的数量为CK+BOF1处理的6.5倍。田间小区试验,苗床育苗和移栽时都施用BOF并加灌a4发酵液的处理（n+F+a4）,根际土和非根际土中病原菌的数量分别为2.0103和2.8103 cfu/g,而对照则分别为1.4104和1.2104 cfu/g。n+F+a4处理生长120 d的药菊生物量（干重）为对照的4.47倍,生防效果达93.2%。采用苗床育苗和移栽时都施用高效拮抗菌的方法,能有效防止枯萎病发生,促进药菊植株生长,提高产量。     

生物有机肥育苗防控烟草青枯病

【目的】烟草青枯病是影响贵州烟叶生产的主要土传病害之一。生物防控方法作为防控烟草青枯病体系的有效措施之一,寻求经济可行的途径势在必行。【方法】利用实验室自主筛选到的烟草青枯菌拮抗菌NJL-14,通过二次固体发酵研制成烟草专用拮抗青枯病型生物有机肥 (BIO),选取K326和红花大金元两个烟草品种分别进行育苗和盆栽试验。育苗床基质分别添加BIO 1%、2%、3%、4%和5%,以确定适宜的BIO育苗添加量。盆栽试验两个品种分别设定五个处理:常规基质育苗 + 植烟健康土壤(CKn+CKp）、常规基质育苗?+?青枯病病土（CKn+Rs）、常规基质育苗?+?青枯病病土?+?有机肥(CKn+OFp)、常规基质育苗?+?青枯病病土?+?BIO(CKn+BIOp)、育苗和盆栽病土中都施入BIO(BIOn+BIOp)。分别采用荧光定量PCR和Biolog-ECO研究育苗基质和盆栽土壤中细菌和真菌数量变化,以及微生物功能多样性,特别是烟草青枯菌及其拮抗菌的消长关系。【结果】当BIO浓度在2%以内时,烟草的发芽率与对照无显著差异;与普通漂浮育苗相比,托盘育苗不但能稳定和延长拮抗菌NJL-14在根际的定殖,而且显著提高烟苗生物量,K326经BIO育苗处理的烟苗地上部和地下部的干重分别比常规基质育苗的处理高17.2%和30.8%,而红花大金元分别高14.9%和20.0%;采用育苗与移栽土壤双重使用BIO模式对烟草青枯病的防控效果明显,防控效果可以达到100%,明显优于只在盆栽中使用BIO模式,并且能够显著抑制土壤中病原菌数量在107 cfu/g土以下,同时有效提高土壤微生物生态多样性。【结论】采用育苗与移栽土壤双重使用烟草专用拮抗青枯病型生物有机肥模式可有效防控烟草青枯病,控制土壤中病原菌数量,改善土壤微生物功能多样性,为有效地生物防控烟草青枯病奠定基础。     

烟草根系分泌物酚酸类物质的鉴定及其对根际微生物的影响

【目的】烟草连作已导致土传病害发生、 烟株生长受抑制、 产量下降和品质恶化等问题。烟株对自身及土壤微生物产生的化感作用,是烟草产生连作障碍的一个重要原因,其中化感物质中的根系分泌物是烟株与土壤微生物间相互作用的重要物质,探索烟草根系分泌物对根际微生物生长的影响是生物防控烟草青枯病的理论依据。【方法】本文利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术,分离、 鉴定烟草根系分泌物中主要酚酸类物质的种类和含量; 通过添加外源酚酸类物质,研究在液体培养基中烟草根系分泌物中的主要酚酸类物质对病原菌及拮抗菌的影响,并在土壤中添加鉴定出的主要酚酸类物质; 通过土壤培育试验,研究其对土壤微生物多样性和数量变化,特别是对烟草青枯病菌及其拮抗菌生长的影响。【结果】1)烟草根系分泌物粗提物对病原菌(茄科劳尔氏菌)生长的促进率为16.8％,对拮抗菌(短短芽孢杆菌)的生长抑制率达到29.4％; 2)UPLC-Q-TOF/MS检测根系分泌物中主要酚酸类物质为苯甲酸和3-苯丙酸,含量分别为0.25 μg/g干根重和1.15 μg/g干根重; 3)液体培养外源添加低浓度的苯甲酸(≤ 2 μg/L)和3-苯丙酸(≤ 3 μg/L)促进病原菌和拮抗菌的生长; 4 μg/L的苯甲酸对病原菌生长抑制作用不显著,对拮抗菌生长的抑制率达到90.2％,6 μg/L的 3-苯丙酸对病原菌的生长具有促进作用,对拮抗菌的生长抑制率达到81.1％,外源高浓度苯甲酸(≥4 μg/L)和3-苯丙酸(≥ 7 μg/L)抑制病原菌与拮抗菌的成长; 4)土壤中添加3 μg/kg土的苯甲酸时,土壤中病原菌的数量增加12.3％,而拮抗菌的数量减少21.0％,土壤细菌、 放线菌和真菌的数量分别降低37.5％,41.9％和55.6％; 3-苯丙酸浓度达到8 μg/kg土时,拮抗菌生长量减少14.5％,对病原菌没有显著影响,土壤细菌、 放线菌和真菌的数量分别降低69.9％,57.2％和80.7％; 5)土壤添加4 μg/kg的苯甲酸和7 μg/kg的3-苯丙酸后,土壤微生物Shannon指数、 Simpson指数、 McIntosh指数显著下降,分别仅为对照的57.7％、 94.1％、 88.1％和97.6％ 73.3％、 80.0％。【结论】烟草根系分泌物粗提物促进病原菌生长抑制拮抗菌生长,根系分泌物中酚酸类物质主要为苯甲酸和3-苯丙酸,液体培养中4 μg/L的苯甲酸或6 μg/L的 3-苯丙酸浓度是对病原菌生长抑制不明显但显著抑制拮抗菌生长的分界点,土壤外源添加3 μg/kg的苯甲酸或8 μg/kg的3-苯丙酸时,是土壤增加病原菌减少拮抗菌数量的分界点,同时土壤微生物功能多样性显著下降,病原菌对根系分泌物中苯甲酸和3-苯丙酸的利用优于拮抗菌,这也是烟草长期连作引起青枯病暴发流行的机理之一。     

GFP标记的植物促生菌B96-Ⅱ-gfp的定殖能力研究

采用绿色荧光蛋白基因标记技术研究了植物促生菌B96-Ⅱ的标记菌B96-Ⅱ-gfp在盆栽黄瓜土壤中的时间、空间定殖动态以及在黄瓜植株上的分布。研究表明: B96-Ⅱ-gfp在土壤中具有持久的定殖能力, 接种180 d时在自然土和黄瓜枯萎菌病土中的定殖数量分别为2.7×10⁴ cfu·g^-1和6.6×10⁴ cfu·g^-1, 360 d时在土壤中仍可检测到B96-Ⅱ-gfp的存在。B96-Ⅱ-gfp可在盆栽植株生长土壤的表层(0~4 cm)、中层(4~8 cm)和底层(8~12 cm)定殖, 定殖数量随土壤深度的增加而增加。此外, B96-Ⅱ-gfp还可在黄瓜的根、茎和叶上定殖, 根部定殖的数量(7.2×10⁴ cfu·g^-1)显著高于茎部和叶部定殖的数量; 黄瓜植株体内定殖的数量多于体表定殖的数量。对土壤中可培养的3大微生物类群影响的研究表明: B96-Ⅱ-gfp对土壤中真菌数量具有显著抑制作用, 而对细菌和放线菌数量则没有明显影响。防病促生试验表明: B96-Ⅱ-gfp可增加黄瓜株高、鲜重和干重, 对黄瓜枯萎病有一定的防治效果, 且与未标记菌株B96-Ⅱ的防病促生作用无显著差异。     

辅以拮抗菌的有机肥对辣椒疫病生防效果的研究

采用盆栽试验的方法 ,研究了辅以拮抗菌的有机肥对辣椒疫病生防效果的作用 ,并研究了有机肥施用对拮抗微生物在辣椒根际定殖以及根际微生物区系的影响 ,结果表明 :施用有机肥 ,与对照相比 ,可降低发病率 35 % ,辅以拮抗微生物的有机肥与直接使用拮抗菌相比 ,前期效果不如后者 ,但后期发病率明显降低 ,同时使拮抗微生物在辣椒根际定殖数量提高了 14 3倍     

Antagonist Bacillus subtilis HJ5 controls Verticillium wilt of cotton by root colonization and biofilm formation

Cotton plants that are continuously subjected to monoculture suffer greatly from Verticillium wilt disease. The application of a novel bioorganic fertilizer (BOF) consisting of organic fertilizer combined with the antagonistic Bacillus subtilis strain HJ5 significantly suppressed Verticillium wilt of cotton. The disease incidence rates in soils that were treated with BOF (1 %, w/w) in the nursery stage, in the transplanted soil stage or in both stages, decreased by 42.9 %, 57.1 %, and 88.0 %, respectively, compared with controls. B. subtilis HJ5 was tagged with a plasmid-borne gfp gene encoding the green fluorescent protein to investigate its colonization behavior on cotton root surfaces. The results indicated that B. subtilis HJ5 predominantly colonizes the elongation and differentiation zones of the roots and forms micro-colonies in hydroponic and soil systems. The population of B. subtilis HJ5 in the rhizosphere and on cotton roots was also monitored. The number of B. subtilis HJ5 cells on the root surface reached a peak value of approximately 10⁷ cfu per gram of roots 3 days after exposure of the cotton seedlings to the bacteria. Probably the colonization of B. subtilis HJ5 on cotton roots is one of the mechanisms involved in protecting cotton plants from fungal infection.     

Genetic tagging of Azotobacter chroococcum for colonization on wheat (Triticum aestivum) and cotton (Gossypium sp.) roots

Abstract

Azotobacter chroococcum strains E12, HT57 were genetically tagged with lac Z, gfp to study the colonization behaviour on wheat (Triticum aestivum) and cotton (Gossypium sp.) in soil under controlled conditions. 10³ – 10⁴ cfu g^?1 soil of HT57 lac Z were found to colonize roots of both cotton and wheat crops whereas 1.7 × 10⁴ – 7.2 × 10⁴ cfu g^?1 soil of E12 gfp was colonizing wheat roots and 1.6 × 10⁴ – 9.3 × 10⁴ cfu g^?1 soil of E12 gfp colonized cotton roots respectively. Tagged strains colonized mostly on root tips compared to basal roots in both the crops.     

生防链霉菌配施棉秆炭对连作棉田土壤微生物区系的影响

棉花是重要的经济作物,长期连作能引起棉花土壤微生态的失衡、土传病害加重、进而导致产量和品质的下降,影响棉花产业的健康发展。本文以连作棉田土壤为研究对象,进行室内培养试验,在施用生防放线菌黄三素链霉菌(Streptomyces flavotricini)的基础上添加不同量的棉秆炭[0 g·kg~(-1)(CK)、25.0 g·kg~(-1)、50.0 g·kg~(-1)、100.0 g·kg~(-1)],采用微生物计数和16S rDNA基因序列分析的方法,研究两者配施对连作棉田土壤中生防菌数量、微生物数量和种类的影响,为棉花黄萎病的生物防治提供新的思路。研究结果表明:(1)生防放线菌配施棉秆炭对连作棉田土壤中微生物区系有显著的影响。与单施生防放线菌菌剂的处理相比,两者配施显著增加了土壤中细菌、放线菌和真菌数量,其中配施25.0 g·kg-1棉秆炭处理使土壤中细菌/真菌数量比(B/F)、放线菌/真菌数量比(A/F)分别增加了5 271.2%和30.8%(P0.05)。(2)土壤中生防放线菌数量随着棉秆炭施用量增加而显著增加,配施100.0 g·kg~(-1)棉秆炭处理显著增加了2 672.8%(P0.05)。棉秆炭具有作为生防放线菌良好载体的潜力。(3)生防放线菌配施棉秆炭也改变了土壤中优势微生物的数量和比例,尤其提高了细菌中芽孢杆菌的数量和所占的比例;100.0 g·kg~(-1)棉秆炭与菌剂配施使土壤中链霉菌的数量及比例显著高于对照,但降低了小单孢菌数量;增加了真菌中米曲梅、黑曲霉和木霉的数量,但使其所占比例降低。由此可以看出,生防放线菌配施棉秆炭能提高连作棉田土壤中生防放线菌的数量,增强生防菌制剂的防病促生作用,改善连作棉田土壤微生物群落结构,在防控棉花连作障碍上具有较大的应用潜力。     

花生连作红壤芽孢杆菌的群落多样性及其生防效果研究

芽孢杆菌是土壤中常见的微生物类群,在土壤生态系统中占据重要地位。本研究发现低丘红壤区花生连作红壤中芽孢杆菌的数量为2.0×105 ~ 2.3×105 cfu/g 干土。通过构建3个样品的基因文库,共得到9个种类;16S rDNA 测序结果表明该地区芽孢杆菌的优势类型有短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、高地芽孢杆菌,分别占总克隆的54%、12% 和14%。并研究了施用不同微生物制剂对连作花生产量和生育性状的影响,结果显示,施用光合细菌和枯草芽孢杆菌能够在一定程度上提高花生的产量,枯草芽孢杆菌和光合细菌混合施用的增产效果最好,比对照提高了32.14%。     

Colonization of sugarcane plantlets by mixed inoculations with diazotrophic bacteria

Micropropagated sugarcane plants have been used in Brazil for almost three decades. Besides the improvement in plant health, micropropagated sugarcane carries no endophytic plant growth-promoting bacteria. The Brazilian inoculation technology to reintroduce diazotrophic bacteria in micropropagated sugarcane plantlets revealed a synergistic-like effect in PGP-bacteria mixed inoculations. The infection model of single diazotrophic bacteria species in sugarcane was studied in detail, but still many questions remain open. In this study we used a combined fluorescence in situ hybridization (FISH) and a cultivation based approach (MPN) to evaluate the colonization of sugarcane plantlets by mixed inocula. The highest colonization for three out of the five species studied was obtained with a mixed inoculum, when the Azospirillum amazonense showed an increase by almost 100 times in colonization and Herbaspirillum spp. and Burkholderia tropica was determined at 10⁷ cells per gram root fresh weight. All of the inoculated bacterial species could be detected using the FISH probes 12 h after bacterial inoculation. The FISH results confirmed the MPN counts and showed differences in the population numbers and colonization behavior of particular bacterial inoculum strains in the different mixed inocula. A putative antagonistic effect among the inoculated H. seropedicae and H. rubrisubalbicans strains was observed using FISH, as well as the better competitiveness of B. tropica as compared to the A. amazonense strain. The observed data probably reflect also specific interactions with the sugarcane variety used in this particular inoculation system, and may not be generalized as a rule. This is the first study about the competition for sugarcane colonization in a mixed bacterial inoculum.     

转基因抗虫棉对茎部内生细菌多样性的影响

比较转Bt基因抗虫棉与其母本茎部内生细菌多样性,为评估转基因棉花生物安全性提供基础数据.采用平板培养方法对转基因棉花(中棉30,TC)与其母本(中棉16,CC)茎部内生细菌进行分离与计数,用细菌的通用引物扩增细菌的16SrDNA片段,进行RFLP分析.采用培养方法分离与计数所得的棉花茎部内生菌数量为105 cfu/g;...