根癌农杆菌介导欧美杨108遗传转化体系的优化

[目的]优化根癌农杆菌介导的欧美杨108遗传转化体系。[方法]以欧美杨108无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行优化研究。[结果]试验获得的优化转化体系如下:农杆菌介导欧美杨108遗传转化的潮霉素最佳叶片分化浓度为2mg/L,生根浓度为1 mg/L。优化筛选的最适转化条件为:预培养48 h,菌液浓度OD600为0.4,侵染15 min,共培养48 h。试验共获得18个抗性愈伤和抗性芽,转化频率为4.3%;经PCR检测初步证明TCS基因已整合至欧美杨108再生植株中。[结论]该研究建立了高效欧美杨108叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

英国薰衣草叶盘遗传转化体系的创建

[目的]以英国薰衣草叶片为材料,创建稳定高效的农杆菌介导薰衣草的遗传转化体系.[方法]未经预培养的英国薰衣草叶片,在OD600=0.4的根癌农杆菌菌液中浸染10 min,共培养1d后,在Cef抑菌浓度为300 mg/L、Kan筛选浓度为30 mg/L的选择培养基上诱导芽分化,抗性芽在Kan浓度为10 mg/L生根培养基上诱导生根.[结果]对筛选得到的65株抗性苗进行PCR检测,获得2株阳性植株,转化率达到3.00;.[结论]建立了稳定高效的农杆菌介导英国薰衣草的遗传转化体系.     

农杆菌介导的莴笋遗传转化体系初步研究

为了研究农杆菌介导的莴笋遗传转化的影响因素,建立莴笋高效遗传转化体系,通过设置不同预培养、共培养时间,探讨其对外植体芽分化率的影响;设置不同农杆菌菌液浸染浓度及浸染时间,探讨其对外植体致死率的影响。试验结果表明,对莴笋外植体预培养2d,外植体芽分化率最高;共培养0、1、2d,外植体芽分化率差别不大;当农杆菌菌液OD600值为0.3、0.5,分别侵染1、3、5min,外植体致死率相差不大。因此,在莴笋遗传转化中,采用外植体预培养2d、共培养2d,农杆菌菌液OD600值为0.5、侵染时间5min的遗传转化体系能提高莴笋的遗传转化率。     

农杆菌介导的吴屯杨遗传转化体系的建立

[目的]建立以农杆菌介导的吴屯杨遗传转化体系。[方法]以吴屯杨无菌苗叶片为遗传转化受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,结合草甘膦(PPT)筛选,探讨影响吴屯杨叶片遗传转化效率的重要因素。[结果]吴屯杨叶片分化不定芽和生根的草甘膦临界浓度分别为0.8、0.6 mg/L。对预培养2～3 d的叶片,用OD600=0.4～0.5的菌液侵染10～15 min、共培养培养基中添加乙酰丁香酮(AS)200μmol/L、共培养3 d可有效提高吴屯杨遗传转化效率。对成活的转基因植株进行PCR检测,结果表明目的基因已转入吴屯杨中。[结论]该研究为进一步加强吴屯杨分子育种研究奠定了坚实的基础。     

农杆菌介导小黑杨花粉植株转化体系的建立

通过对影响根癌农杆菌介导小黑杨花粉植株转化效果各种因素的研究,建立了小黑扬花粉植株高效稳定的转化体系.研究结果表明:小黑杨花粉植株叶片外植体在分化培养基中预培养2 d,用OD600值为0.1的工程菌液侵染3～5min,黑暗条件下共培养2～3 d,采用适宜的脱菌方法有利于提高遗传转化率,而用在培养基中加入CaCl2则不利于遗传转化:叶片外植体与农杆菌共培养后.经过抗性芽的诱导、叶片的冉分化和根的再生,3个月后即可获得抗性苗;抗性植株经PCR和Southem斑点杂交检测,表明外源基因已转入小黑杨花粉植株的基因组中.     

百合遗传转化体系的建立

通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立了百合金黄精灵(ButterPixie)鳞茎的遗传转化体系。确定了适宜百合转化的筛选剂草甘磷的浓度:芽分化阶段为1.6mg.L-1,根分化阶段为0.8mg.L-1。除菌剂头孢的使用浓度为500mg.L-1。并且确定OD600=0.5的菌液浓度侵染20min,共培养pH5.2培养3d时对百合有最高转化效率。研究确定了预培养时间为4d,在共培养培养基中去除NH4NO3或加入阿魏酸均可提高转化效率。得到抗性植株12株,PCR初步检测发现其中7株为PCR阳性植株,转化效率为58.3%。     

根癌农杆菌介导的悬铃木叶片遗传转化体系研究

以葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因瞬时表达率为指标,研究了不同因子对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的悬铃木叶片遗传转化系统的影响.结果表明,预培养9 d的悬铃木叶片在OD600值为0.7的根癌农杆菌菌液中浸染10 min后,再在含有100μmol.L-1的乙酰丁香酮的共培养培养基上黑暗条件下共培养3 d叶片的遗传转化效率最高.该体系为进行农杆菌介导目的基因培养悬铃木新品种奠定了基础.     

农杆菌介导的多裂叶荆芥转化体系建立

为了建立根癌农杆菌介导的多裂叶荆芥转化体系,以携带pBI121-gfp质粒的根癌农杆菌LBA4404菌株介导,荆芥试管苗带叶腋茎段为转化受体材料,探究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间4个因素对荆芥转化效果的影响。每个因素设置4个水平,以L16(45)正交实验进行,筛选的卡那霉素抗性芽进行GFP荧光检测和PCR检测。结果表明,gfp基因成功导入转化植株,预培养5d、菌液浓度OD600为0.7、侵染15min、共培养3d为多裂叶荆芥的最优转化条件。转化率为20%,每个外植体再生抗性不定芽数平均为5个。荆芥转化体系的建立为利用植物基因工程改良其遗传性状奠定基础。     

根癌农杆菌介导转录因子CBF1基因对菊花的转化

利用根癌农杆菌介导法对菊花品种'小金黄'叶片进行遗传转化,研究影响菊花转化的若干因素,建立一套高效的遗传转化体系.结果表明:2 d的预培养,OD600值约为0.5的农杆菌菌液添加50 mg/L AS,侵染时间3 min,2 d的共培养,从分化培养基获得的抗性芽在生根培养基MS+0.4 mg/L NAA+10 mg/L Km+100 mg/L Cef上进行延迟筛选,有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,CBF1基因已整合到菊花基因组中,共获得18株转基因植株,在抗性株系中PCR阳性率为36.7%.     

美洲黑杨遗传转化系统优化的研究

 研究了影响根癌农杆菌（Agrobaterium tumefaciens Conn）介导的美洲黑杨遗传转化的若干因素,建立了美洲黑杨简单、高效的遗传转化系统,获得了大量转基因植株。结果表明：外植体预培养3d,菌液浓度OD600值为0.4~0.6的农杆菌中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化系统,转化率最高时可达10.0%。同时发现选择带叶柄的叶片作为转化受体,转化频率也有明显提高且不同分化培养基的配方对美洲黑杨的转化效果也有一定影响。     

AP70抗病基因转化番茄的研究

[目的]通过基因工程提高番茄抗病性。[方法]通过冻融法将含萝卜抗真菌蛋白基因的质粒AP70转入农杆菌LBA4404中,再用农杆菌介导法将AP70抗病基因对番茄进行遗传转化,研究预培养、侵染时间等因素对AP70转化番茄的影响。[结果]带柄子叶诱导番茄产生不定芽的效率比子叶块效率高。农杆菌浸染番茄子叶前预培养1 d,不仅能提高子叶存活率,而且可降低共培养时外植体的污染率。农杆菌对番茄子叶的侵染时间最好不超过5 min。外植体筛选培养基中Kam的浓度不宜太高或太低,可获得少量转AP70基因的抗性芽。[结论]农杆菌对番茄子叶侵染前要进行稀释,且侵染时间不宜超过5 min,共培养1 d时转化率较高。     

应用正交试验法优选茎瘤芥高效遗传转化体系

[目的]建立茎瘤芥高效遗传转化体系,为茎瘤芥及芸薹属植物遗传转化奠定基础。[方法]应用正交试验法研究茎瘤芥遗传转化过程中预培养时间、共培养时间、侵染液浓度、侵染时间、对转化率的影响。[结果]最适合茎瘤芥CRY2基因RNAi载体遗传转化的条件为预培养3 d、共培养4 d、侵染液浓度OD600=0.5、侵染10 min,此时Kana选择压为30 mg/L。[结论]优选出了农杆菌转化的最宜条件,遗传转化率有较大提高。     

镉胁迫对石竹种子萌发·叶片叶绿素及同工酶的影响

[目的]研究重金属镉胁迫对石竹种子萌发、叶绿素及同工酶的影响。[方法]镉胁迫设5个处理（0、0．5、5．0、10．0、50．0mg／L）,对石竹种子浸泡后测定其发芽率;对新鲜石竹浸泡后测定其叶绿素含量和同工酶。[结果]低浓度的镉对石竹的生长有促进作用,其中镉为5．0mg／L时的发芽势比对照高15．83％;高浓度的镉抑制其生长,对根的抑制作用大于芽。随着处理时间的推移和镉浓度的增加,石竹叶绿素含量在减小,镉为5．0mg／L处理20d时,镉浓度与时间相关系数为-0．789;在同一处理时间内,镉浓度与叶绿素均呈显著负相关。镉胁迫下对石竹叶POD的影响主要表现为个别酶带Rf值的改变、酶带数的下降和活性的增加。[结论]重金属镉对石竹的酶活性产生影响,使其对镉胁迫产生了相对适应性。     

农杆菌介导的中华补血草遗传转化体系的建立

[目的]为利用转基因技术培育中华补血草新品种奠定基础。[方法]对农杆菌介导的中华补血草转化体系中的各种影响因素进行了系统研究,以构建中华补血草的遗传转化体系。[结果]中华补血草叶片对卡那霉素敏感,以50 mg/L卡那霉素作为补血草叶片转化受体较为适宜。400 mg/L特美汀能有效抑制农杆菌,而500 mg/L头孢曲松钠则不能。菌株EHA105对中华补血草的转化率达15%,远高于菌株LBA4404和GV3101。对于侵染中华补血草无菌苗叶片的重悬菌液,以OD600为0.7~1.0为宜。4 d共培养的效果较好,15.6%外植体可分化成芽。PCR检测结果表明30株卡那霉素抗性植株均为阳性,而阴性对照未扩增到条带,表明NPTⅡ外源基因已整合到受体植物基因组中。[结论]影响中华补血草转化率的关键因素是农杆菌菌株的选择。     

农杆菌介导大豆萌动种子遗传转化的影响因素研究

[目的]提高农杆菌介导大豆遗传转化效率。[方法]以萌发1 d的半片大豆种子为目标组织,通过GUS瞬时表达检测,研究乙酰丁香酮、菌液的浓度及侵染时间对转化效率的影响。[结果]在共培养基中添加200μmol/L的乙酰丁香酮时,GUS瞬时表达效率最高。当农杆菌生长到对数生长期(D600 nm=0.5)时,转化效率最高,平均每个外植体上出现9.4个蓝色斑点。农杆菌侵染时间不宜过长,以30~60 min较好。[结论]乙酰丁香酮浓度、农杆菌菌液浓度和侵染时间均影响农杆菌介导大豆遗传转化效率。     

农杆菌介导草地早熟禾转化条件的优化

[目的]提高草地早熟禾的转化频率。[方法]以草地早熟禾的丛生芽芽尖为转化受体,研究了影响农杆菌转化草地早熟禾频率的有关因素。[结果]农杆菌悬浮液浓度OD600=0．6,并添加0．1mmoL／L乙酰丁香酮,在50kPa真空处理5min,获得的抗性芽比例较高,最大达15．19％。[结论]农杆菌悬浮液浓度、真空渗透处理及乙酰丁香酮的诱导均能影响草地早熟禾的转化频率。     

农杆菌介导CBF1基因转化安祖花的研究

[目的]为获得耐低温安祖花奠定基础。[方法]利用农杆菌介导CBF1基因侵染安祖花,并研究不同浓度乙酰丁香酮(AS)和侵染时间对转化后安祖花抗性愈伤组织的存活率和抗性芽分化率的影响。[结果]以重组质粒pBI121-CBF1为模板,利用CBF1cDNA全长的引物序列进行PCR扩增,获得约650bp的片段,表明重组质粒构建成功。在抗性培养基上筛选12周后,部分愈伤组织褐化死亡。用100μmol/LAS作为诱导物质时,抗性愈伤组织存活率和抗性芽的分化率较高。农杆菌侵染时间对转化后愈伤组织存活率和抗性芽分化率有一定影响。[结论]当AS浓度为100μmol/L、侵染时间为10min时,抗性愈伤组织的存活率及分化率最高,分别为48.6%和11.46%。     

甘菊遗传转化再生体系的建立

[目的] 建立高效稳定的甘菊再生体系,并确定卡那霉素和草丁膦的筛选压。[方法] 以甘菊无菌苗叶片为外植体,通过添加不同浓度的NAA和6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系。[结果] 在5种芽诱导培养基中,MS3（MS＋NAA 0.1mg/L＋6-BA0.1mg/L）的再生频率最高,可达98%,其不定芽生根率可达100%。培养35d后,添加5和10mg/L卡那霉素的培养基上甘菊再生率为11.3%和10%,添加15和20mg/L卡那霉素的培养基上没有芽的分化;添加0.5mg/L草丁膦的培养基上甘菊再生率为8.7%,添加1mg/L草丁膦的培养基上没有芽的再生,添加1.5和2.0mg/L草丁膦的培养基上没有芽的分化。卡那霉素和草丁膦在甘菊遗传转化中的筛选浓度分别为8.0和0.8 mg/L。[结论] 该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。     

提高草木犀遗传转化植株再生率技术的研究

[目的]确定草木犀遗传转化植株的适宜的除草荆选择压力。[方法]分别以草木犀试管苗的子叶、下胚轴和破坏生长点的茎尖为外植体,在含有0、1、3、5、10mg／L除草剂草丁膦的分化培养基Ms＋BA3mg/L＋LAA0．2mg/L中对其进行分化培养,筛选适宜的除草剂选择压力,在此选择压力下,对外植体进行遗传转化,并对转化芽进行分子水平检测。[结果]当除草剂浓度为3mg/L时,所有外植体均无再生芽;转化培养后,子叶、下胚轴和破环生长点的茎尖的再生率分别为0．48％、4．29％和10．1t％;分子水平检测结果显示,外源基因已成功转入草木犀转化芽中。[结论]除草剂对草木犀外植体的适宜选择压力为3mg／L,破坏生长点的草木犀茎尖对外源基因的转化效率较高。     

PP333对百合试管苗壮苗和生根的影响

[目的]探索多效唑的适宜浓度,提高百合试管苗的质量和移栽成活率。[方法]研究不同浓度PP333(0.3、0.5、1.02、.0和3.0 mg/L)对百合试管苗的壮苗和生根的影响。[结果]适当浓度的多效唑能明显提高百合试管苗不定芽分化的数量,促进试管苗根的分化,提高生根的数量。多效唑对百合植株有显著的矮化作用。随着PP333浓度的增加,其矮化效果明显加强。1.0 mg/L PP333能有效地壮苗并起到矮化的作用;当PP333浓度为0.3~1.0 mg/L,百合试管苗的生根率和平均根数明显高于对照;当PP333浓度为2.0~3.0 mg/L时,百合试管苗的根变黄、变短。这说明低浓度PP333对百合试管苗的生根有明显促进作用,而高浓度PP333对百合试管苗生根有明显的抑制作用。[结论]适于百合壮苗的最佳PP333浓度为1.0 mg/L。