一起冠状病毒引起的牦牛犊牛腹泻的分子诊断

2018年7月,青海省玉树地区一牦牛养殖户2～3月龄的犊牦牛爆发以腹泻为主要症状的疾病。本实验的目的是调查腹泻的病因并了解病原的分子特征。无菌采集9份犊牦牛腹泻粪便样本,采用PCR检测方法对牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌、安氏隐孢子虫等6种常见致腹泻病原进行了检测。结果显示,9份样本中有6份为牛冠状病毒阳性,其它5种病原均未检出。对6份阳性样品进行冠状病毒S1亚基基因扩增,序列分析显示,6份样品中冠状病毒S1亚基有7个共同的氨基酸变异,区别于GenBank登录的冠状病毒该段氨基酸序列。系统发育显示6株冠状病毒的S1亚基基因有独特的遗传进化趋势。本实验结果为当地牦牛腹泻的防控提供了参考。     

四川省理塘县牦牛感染泰勒虫的分子流行病学调查及虫种鉴定

为调查四川省理塘县牦牛泰勒虫的感染情况及流行规律,2019年5-11月和2020年4-10月自理塘县采集临床健康牦牛全血共345份,采用以18S rRNA为靶基因的巢式PCR方法进行泰勒虫检测,分析理塘县牦牛泰勒虫感染的季节规律、年龄段、体重变化、性别特点,对全部泰勒虫核酸检测阳性样本共计65份进行虫种鉴定.结果 显示...     

大通犊牦牛组织中线粒体SDH活性与其亚基mRNA表达的测定

为探讨高原低氧环境下大通犊牦牛线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)在不同组织中的表达模式以及SDH活性与其亚基mRNA表达量之间的关系,采用酶联免疫分析法(ELISA)对犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织中线粒体SDH活性进行测定;实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测组织中Sdha、Sdhb、Sdhc和Sdhd亚基mRNA表达量。结果表明:大通犊牦牛大脑、心肌、骨骼肌组织中线粒体SDH活性显著高于乐都犊牦牛;大脑组织中线粒体Sdh4个亚基mRNA表达量极显著高于乐都犊牦牛。结论:含野血大通犊牦牛组织线粒体SDH有氧代谢功能强于乐都犊牦牛;大脑组织线粒体Sdh4个亚基转录水平较高;大通犊牦牛大脑组织线粒体SDH活性与Sdh4个亚基mRNA表达量呈正相关。     

西藏牦牛12SrRNA基因全序列测定及系统进化关系

以西藏11个地区的牦牛类群共计110头为研究对象,采用PCR方法,首次从耳组织总DNA中扩增出了线粒体12SrRNA基因,并进行了序列测定及分析。结果表明,该基因的长962～965bp;序列分析表明12SrRNA基因有较高的进化速率,11个地区的牦牛品种同源性相对较高;对11种类群的牦牛及亚洲水牛、非洲水牛、欧洲野牛和家牛四种牛亚科的12SrRNA基因序列建立NJ和ME分子进化树,结果显示帕里牦牛、斯布牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、江达牦牛、工布江达牦牛、康布牦牛与桑日牦牛的亲缘关系最近。     

一起犊牦牛腹泻病的病原学诊断

四川省若尔盖县某养殖户的犊牦牛出现以腹泻为主要特征的疾病,传播迅速,发病率为100%,为弄清病因,我们采集了6份腹泻样本,分别用Trizol法和酚氯仿法提取腹泻粪便的总RNA和DNA,再用牦牛轮状病毒(RV)、牛冠状病毒(Bco V)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、沙门氏菌(Salmonella)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)特异的PCR方法进行病原检测,结果得出这5种病原的检出数分别为6、0、6、0、5,可见该地区犊牦牛腹泻主要由RV、BVDV和ETEC混合感染引起。     

四川省甘孜州牦牛梨形虫感染情况的调查

试验旨在调查甘孜藏族自治州（甘孜州）全部18个县（市）牦牛梨形虫的感染情况。2018年6月至11月采集甘孜州18个县（市）临床健康牦牛全血1 381份,采用靶向18S rRNA的巢式PCR进行梨形虫核酸检测,并挑选梨形虫核酸检测阳性样本PCR产物共计124份测序鉴定虫种。结果显示,1 381份牦牛样本中梨形虫核酸阳性样本438份,平均阳性率为31.72%,其中半农半牧业县1 093份牦牛样本中梨形虫核酸阳性样本385份,平均阳性率为35.22%,纯牧业县288份牦牛样本中梨形虫核酸阳性样本53份,平均阳性率为18.40%;124份牦牛梨形虫核酸阳性样本中鉴定出感染的虫种有中华泰勒虫76份、吕氏泰勒虫25份、东方泰勒虫3份、绵羊泰勒虫2份、双芽巴贝斯虫1份和水牛泰勒虫1份,其中中华泰勒虫感染率为61.29%,吕氏泰勒虫感染率为20.16%。本试验结果表明,甘孜州牦牛梨形虫感染率较高,不同地区之间存在差异,优势虫种为中华泰勒虫和吕氏泰勒虫,为甘孜州牦牛梨形虫病防控提供了重要参考。     

四川省甘孜州牦牛梨形虫感染情况的调查

试验旨在调查甘孜藏族自治州(甘孜州)全部18个县(市)牦牛梨形虫的感染情况。2018年6月至11月采集甘孜州18个县(市)临床健康牦牛全血1 381份,采用靶向18S rRNA的巢式PCR进行梨形虫核酸检测,并挑选梨形虫核酸检测阳性样本PCR产物共计124份测序鉴定虫种。结果显示,1 381份牦牛样本中梨形虫核酸阳性样本438份,平均阳性率为31.72%,其中半农半牧业县1 093份牦牛样本中梨形虫核酸阳性样本385份,平均阳性率为35.22%,纯牧业县288份牦牛样本中梨形虫核酸阳性样本53份,平均阳性率为18.40%;124份牦牛梨形虫核酸阳性样本中鉴定出感染的虫种有中华泰勒虫76份、吕氏泰勒虫25份、东方泰勒虫3份、绵羊泰勒虫2份、双芽巴贝斯虫1份和水牛泰勒虫1份,其中中华泰勒虫感染率为61.29%,吕氏泰勒虫感染率为20.16%。本试验结果表明,甘孜州牦牛梨形虫感染率较高,不同地区之间存在差异,优势虫种为中华泰勒虫和吕氏泰勒虫,为甘孜州牦牛梨形虫病防控提供了重要参考。     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中幼虫芽孢杆菌16S r RNA基因保守序列设计特异性引物和探针,经反应体系及条件优化,建立了检测P.larvae Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:该方法与其它病原无交叉反应;最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏度高100倍;重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3%。应用该方法对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析。     

应用半套式聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒S1基因的研究

根据离呼肠孤病毒S1133毒株S1基因序列，设计合成XZ11、XZ12和XZ11、XZ33两对引物，用半套式PCR对6株禽呼肠孤病毒标准毒株的核酸进行了检测。结果6株ARV均可扩增出和预期大小相符392bp的PCR产物，而对其他6种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性；该半套式PCR比RT-PCR更加敏感，这种方法可以检测出Ifg的ARV RNA模板。     

饲料中鸡源性成分PCR-DHPLC检测方法的建立

以鸡组织为材料,提取鸡组织的线粒体DNA,以鸡12SrRNA基因为靶基因设计引物,PCR反应扩增片段230bp;用13种畜禽和水产动物线粒体DNA验证该PCR引物的特异性,结果只有鸡线粒体DNA为阳性;PCR-DHPLC检测灵敏度在DNA水平上达到了2.04mg/L;在随机采集的22份饲料样品中,检出8份鸡源性成分样品。结果表明,本研究建立的PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地对饲料中的鸡源性成分进行快速准确检测。     

鸭疫里默氏杆菌贵州分离株OmpA及16S rRNA基因序列分析

为了解鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州分离株外膜蛋白A(Omp A)和16 S r RNA基因序列的相关性以及与RA血清型之间的关系,对12株RA贵州分离株通过PCR分别扩增Omp A和16 S r RNA基因,并对其构建系统进化树和分析其系统进化关系。结果显示,12株RA分离株Omp A基因分为2个群,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.9%~100.0%和98.4%~100.0%;Omp A蛋白中有规律的变异位点为100(R/G)、143(S/P)、145(T/I)和268(S/P)。12株RA分离株16 S r RNA基因同属1个群,其核苷酸序列同源性为99.4%~100.0%。结果表明,12株RA贵州分离株Omp A基因和16 S r RNA基因序列所属的基因群无明显相关性,并且与RA血清型的分型也无直接关联。     

高寒区牛内脏组织的采集及其RNA的贮存

牦牛所处环境及生物习性明显不同于普通牛,尤其组织样品获取不易,如何将来之不易的样品长时间高效保存意义重大。为此,本研究以天祝白牦牛及本地黄牛为对象,采集胃肠道、肝脏及肾脏样品,Trizol Kit提取RNA,运用食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)规则及Gel-pro软件分析-80℃保存1个月和23个月的RNA浓度及降解程度,研究RNA的保存与质量检测技术。结果表明,牦牛所有胃组织样品RNA放置23个月后浓度均增加,而黄牛的瘤胃及瓣胃却相反;两个基因型牛种空肠及牦牛回肠组织RNA相对稳定;牦牛和黄牛大肠RNA在保存23个月后浓度存在显著差异(P0.05)。牦牛及黄牛胃部及肝脏和肾脏RNA在保存23个月后,5S条带较清晰,28S和18S条带均不清晰;胃部、肝脏及肾脏28S∶18S在0.34~0.72,肠道28S∶18S在0.43~2.15。高寒牧区牦牛胃肠道等组织按Trizol提取方法可提取高质量的RNA样品,但常规方法保存23个月的RNA样品均会产生不同程度的降解,降解程度亦存在动物基因型及组织部位的差异性。     

牦牛源正呼肠孤病毒2型的检测和分离鉴定

旨在调查川西北牦牛哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)的感染情况并分离病毒.采用RT PCR方法,对采自川西北15个牧场的72份牦牛腹泻粪便样本和其中5个牧场的15份腹泻牦牛血清样本进行MRV检测,阳性样本进一步用分型PCR确定其血清型.结果 显示,粪便样本中MRV检出率为20.83％(15/72),血清2型的比例为60％(...     

大通犊牦牛组织线粒体COX酶活性与亚基COX-Ⅰ、Ⅱ mRNA表达的相关性研究

为探讨"大通犊牦牛"组织线粒体COX活性与亚基COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量之间的关系。采用酶联免疫分析法(ELISA)对犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性进行测定;绝对定量荧光PCR(Real-time PCR)检测组织中COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量。结果显示:大通犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性高于乐都犊牦牛;大通犊牦牛组织间COX-Ⅰ基因拷贝数明显高于乐都犊牦牛(P0.05);大通犊牦牛组织间COXⅡ拷贝数以及乐都犊牦牛COXⅡ拷贝数均差异显著(P0.05),大通犊牦牛不同组织中的COX-Ⅰ、Ⅱ的表达量与乐都犊牦牛相比差异显著(P0.05)。结果表明:含野血的大通犊牦牛组织线粒体COX的氧化磷酸化作用要强于家犊牦牛;线粒体COX两种亚基mRNA变化与组织和品种有关;COX活性变化可使COX-Ⅰ、ⅡmRNA发生失调。     

基于16S rRNA作为基因条形码对生鲜肉品物种检测方法的建立及应用

采用并合成了1对16S rRNA基因通用引物,通过PCR方法扩增了牛、羊、鸡、猪4种动物生鲜肌肉组织的16S rRNA基因,建立了PCR检测生鲜肌肉组织样品物种来源的检测方法。利用该方法,对采自青海西宁及海西州餐饮市场的30份所谓牛羊生鲜肉样品进行PCR检测,均扩增出约422 bp长度的DNA条带,纯化测序后进行序列分析,发现其中检测出11份鲜肉样品为赝品,实为斑嘴鸭(Anas Poecilorhyncha)肉。16S rRNA作为条形码基因对生鲜肉品物种的检测具有快速、特异、敏感、准确等优点,可以作为临床上检测生鲜肉品物种的方法进行市场检测。     

牦牛粪样中蓝氏贾第鞭毛虫巢式PCR检测方法的建立

采用建立的巢式PCR方法检测了297份牦牛粪样。结果表明:建立的巢式PCR方法一扩的最佳退火温度为55℃,二扩的最佳退火温度为53℃;对牦牛源贾第鞭毛虫的最低检测量为1个虫体DNA/m L;特异性试验表明,对隐孢子虫、弓形虫、柔嫩艾美尔球虫、阿米巴虫、牛巴贝斯虫等寄生虫DNA的扩增均为阴性;297份牦牛粪样中贾第鞭毛虫的检出率为7.4%。表明建立的方法具有较高的敏感性和特异性,可用于牦牛源贾第鞭毛虫感染的检测。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定

副猪嗜血杆菌(Hps)为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的重要病原之一。在对广西65个猪场281份病猪组织样品进行PRDC病原学调查的基础上,对PCR检测的Hps阳性样品进行了细菌分离,并进行了生化特性、药敏试验、16 S RNA基因片段序列分析和基因组DNA的PCR指纹图谱分析。结果显示,11份(3.91%)检测样品为Hps阳性,且均为混合感染;从南宁市四塘、桂林市永福、玉林市容县和钦州市浦北分离出5株Hps,分离菌株的生化鉴定结果均符合Hps生化特性,且对头孢噻呋和头孢菌素高度敏感;其中3株为血清5型,1株为血清12型,另1株未能定型;分离菌株16 S RNA基因片段之间及与GenBank其他一些代表菌株的核苷酸同源性在99%以上。     

青海省大通县世居牦牛犊隐孢子虫感染情况调查及虫种鉴定

旨在调查青海省大通县部分地区世居牦牛犊隐孢子虫的感染情况及其虫种类型。在大通县宝库乡和良教乡采集了200份3~5月龄世居牦牛犊粪样进行隐孢子虫检测。所有样品经蔗糖密度梯度离心法纯化处理,采用免疫荧光试验（IFT）方法进行检测,阳性样品再用套式PCR扩增18S rDNA,并进行测序和同源性分析以供虫种鉴定。结果表明：免疫荧光试验（IFT）方法镜检出3份隐孢子虫阳性样品,阳性率为1.5%（3/200）;阳性样品经套式PCR扩增18S rDNA后,有2份隐孢子虫样品呈阳性,扩增产物长度为500 bp,测序后将序列命名为QHDTC201901和QHDTC201902;系统发育分析显示,种类鉴定发现2种隐孢子虫,分别为安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）和牛隐孢子虫（Cryptosporidium bovis）,总感染率为1.0%（2/200）。综上提示,大通县部分地区牦牛犊存在隐孢子虫感染,感染虫种为安氏隐孢子虫和牛隐孢子虫。该调查研究为该地区牛隐孢子虫病的防控提供了临床基本数据。     

阿米巴原虫LAMP检测方法的建立及其应用

为了探索环介导等温扩增技术(LAMP)在牦牛粪便阿米巴原虫检测中的实用性,利用阿米巴原虫的18S rRNA基因序列进行引物设计,在优化LAMP检测方法的同时,对该方法在进行阿米巴原虫检测时的特异性、敏感性、重复性进行分析。结果显示:已建立的阿米巴原虫LAMP检测方法具有一定的特异性,敏感性优于PCR,并具有良好的重复性;在临床应用性方面,其检出率与利用传统PCR得到的检出率完全相同。结果表明:该LAMP检测方法可用于牦牛粪便中阿米巴原虫的检测。     

牦牛和犏牛睾丸CPT1a和ETHE1基因mRNA水平比较研究

试验旨在探索牦牛杂交雄性不育后代（犏牛）睾丸脂肪酸氧化特点及其与雄性不育的关联性,阐明犏牛雄性不育的分子机制。以GAPDH和18S rRNA基因为双内参,建立了牦牛和犏牛肝脏型棕榈酰肉碱转移酶1a（CPT1a）和硫双加氧酶1（ETHE1）基因mRNA水平的实时荧光定量PCR检测方法,结果发现,该实时荧光定量PCR方法扩增特异性好,扩增效率为98.5%~107.8%,标准曲线线性关系好。采集成年牦牛（n=9）和雄性不育犏牛（n=7）睾丸和附睾,通过常规组织切片和HE染色检测,证实犏牛睾丸和附睾中无精子,而牦牛睾丸和附睾中有精子。试验进一步从牦牛和犏牛睾丸中提取总RNA,测定睾丸中CPT1a和ETHE1基因的mRNA水平,结果显示,犏牛睾丸中CPT1a和ETHE1基因mRNA水平分别显著和极显著高于牦牛（P<0.05;P<0.01）。CPT1a基因mRNA水平的提高表明犏牛睾丸中脂肪酸β-氧化能力的加强;而ETHE1基因mRNA水平的增加可促进线粒体呼吸链的电子传递和脂肪酸氧化,或影响其他能量代谢通路,这两种基因mRNA水平的提高均有助于睾丸脂肪酸的β-氧化供能。本研究结果表明,与牦牛睾丸相比,雄性不育犏牛睾丸的脂肪酸氧化供能水平加强,可能对脂肪酸燃料分子有更多的依赖性。