基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。     

A型塞尼卡病毒与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西省的30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。     

猪A型流感病毒RT-PCR的建立及应用

根据GenBank上A型流感病毒M基因的保守序列,设计1对引物,建立了检测猪群中A型流感病毒的RT-PCR方法。试验结果表明,该RT-PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中A型流感病毒的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。     

基因3型猪戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

对GenBank中基因3型猪戊型肝炎病毒(HEV)代表毒株基因进行序列分析,最终选定ORF3基因的部分序列为目的基因,运用生物信息学软件设计特异性引物和探针,扩增获得目的片段,并构建重组载体pUC-19-ORF3。梯度稀释重组质粒制备标准品,初步建立检测基因3型HEV的实时荧光定量PCR方法。对建立的检测方法进行特异性、敏感性和重复性验证。结果表明,标准品浓度在10~8~10~2 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.996。特异性试验结果显示,其它几种常见猪病病原体(猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒)未见典型扩增曲线。敏感性试验证实本方法的最低检测下限为10~1 copies/μL。重复性试验表明该方法对3个标准品检测结果的批内和批间变异系数低于2%。用该方法抽检59份进境猪肉样品,同时用普通RT-PCR方法对这些样品进行符合性试验,结果均为阴性。本研究所建立的检测方法不仅适用于进境猪肉样品中基因3型HEV的监控检测,而且还可用于基因3型HEV的早期临床诊断及分子流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法SYBR Green I荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪流行性腹泻病毒变异毒株快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出猪流行性腹泻病毒变异毒株S基因中298bp的保守序列,并克隆到pM D18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了PEDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5.2×10~1拷贝,与猪流行性腹泻病毒经典毒株、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PEDV变异毒株的检测。     

猪A组轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测猪A组轮状病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.参考GenBank上登录的猪轮状病毒OSU株的VP6基因序列保守区设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法克隆目的基因,并将其连入pMD 19-T Vector,制备阳性标准品,优化反应条件.建立的方法在1.0×102～1.0×109拷贝/μL范围内线性关系良好,反应扩增效率大于90％,扩增相关系数大于0.98.对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒2型均检测不到荧光信号,表明该方法特异性强.该方法批内和批间变异系数均小于2％,重复性好.结果表明,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可为A组猪轮状病毒早期感染的诊断及病毒定量分析提供技术支持.     

塞内卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立塞内卡病毒(SVA)荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测方法,本研究根据GenBank中SVA 3D基因保守区域序列设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以SVA cDNA为模板,经优化反应条件,建立了SVA FQ-PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对28份临床疑似SVA感染样品进行了检测,并与本实验室建立的SVA RT-PCR方法检测结果及测序结果比较分析。结果显示,该方法仅对SVA出现阳性扩增信号,对BHK-21正常细胞对照和口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒等5种病原均未出现扩增,特异性较强;该方法最低检测限为10.4拷贝/μL质粒标准品,比常规RT-PCR敏感性高10倍,敏感性较高;该方法批内及批间变异系数均小于4%,重复性好。利用该方法对28份疑似SVA感染样品检测显示,检出9份阳性样品,与测序结果一致,而常规RT-PCR仅检出6份阳性样品,其敏感性高于常规RT-PCR方法,两种方法的符合率为89.3%。本研究为SVA的早期检测提供了特异、敏感、快速的方法。     

猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用

根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,制备探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。并对217份不同地区的样品进行检测。结果表明：该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒,并显示了较高的灵敏度和特异性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。     

H7和N9亚型及A型流感病毒多重荧光定量RT-RCR检测方法的建立

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性.同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/mL.批内和批间试验的变异系数均小于1.48％.利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份.该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定.     

甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

自甲型H1N1(2009)流感病毒于2009年在世界多个国家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型H1N1(2009)流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。并将该方法与WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法进行比较。通过田间试验验证该方法在实际应用中的效果。结果表明:本研究建立的方法对检测甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的灵敏度达到10-6,与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度一致,并且高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10-5);该方法特异性强,与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应。与香港兽医化验所进行了检测比对,检测灵敏度和特异性完全一致。近3 800份的田间试验表明,所建立的方法准确可靠。本研究所建立检测方法快速灵敏,检测结果准确可靠,适合用于甲型H1N1(2009)流感病毒的分子生物学检测和监测。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。     

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是世界各地重要猪病毒性病原之一,每年给养猪业造成重大损失。本试验建立了应用TaqMan-LNA的荧光定量RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)2种PRRSV检测方法。结果表明荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测下限分别为10²和10¹ 拷贝数/μL,都具有良好的特异性。临床样本检测结果同样表明2种方法都具有良好的特异性和灵敏度。本试验所建立的TaqMan-LNA荧光定量RT-PCR和RT-LAMP可有效的应用于PRRSV的检测。     

SYBR Green Ⅰ实时PCR对猪细小病毒体外复制动态分析

根据已经发表的猪细小病毒（PPV）的VP2基因序列,设计2对特异性引物,建立了检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。该方法最小检出量为12个PPV拷贝。模板稀释度在108范围内呈良好的线性关系,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒无交叉反应。应用本方法对PPV在体外感染细胞后的复制动态进行了观察,并绘制了病毒的体外增殖曲线。数据换算为每瓶中细胞内、外病毒拷贝数,结果显示细胞外病毒含量在接毒初始的36h逐渐下降,随后开始逐步增加;接毒后84h培养液中的病毒含量（1.739×1010拷贝）逐渐超过细胞内的病毒含量（1.321×1010拷贝）;在接毒后108h培养液中病毒含量达到峰值（7.626×1010拷贝）,随即病毒含量开始快速下降。细胞内病毒粒子在接毒后24h内为对数增长期,然后为缓慢增长期,至接种后72h达到复制峰值（1.425×1010拷贝）,并维持至108h。与病毒复制动态变化相对应的细胞病变是从细胞聚集、开始形成空斑到约80%的细胞病变产生,108h之后随着细胞的大量死亡,细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。     

三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT—PCR、直接免疫荧光（ direct immunofluorescence asay, DFA ）及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示,RT—PCR检测试剂盒敏感性最高,DFA鉴别诊断试剂盒次之,病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT—PCR的总符合率分别为92％和85．5％。RT—PCR灵敏性高,可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法;DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好,但需要一定的操作经验;病毒分离敏感性低、操作繁琐,阳性分离需要其它方法验证,不适合于PRRSV的鉴别诊断。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。     

PCV2、PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其应用

根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV2、PRRSV的多重PCR（mPCR）检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5（PRV）、25.2（PCV2）、35.9pg（PRRSV）。该方法对猪流感病毒（SIV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、大肠杆菌、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（TGE）等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%（160/200）,PRV感染率为21%（42/200）,PRRSV的感染率为78%（156/200）。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%（112/200）。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。