绿色荧光蛋白(GFP)基因在Pseudozyma antarctica中的表达

Pseudozyma antarctica隶属于担子菌纲。P．antarctica的双质粒共转化系统包括：pSceI-hyg和pVectour libre，其中pSce I-hyg含有hsp70启动子和终止子以及潮霉素抗性基因；pVectour libre仅含有hsp70启动子和终止子，以便插入要表达的目的基因。设计引物扩增得到绿色荧光蛋白基因后，插入pVectour libre，构建质粒GFP．hsp，将该质粒与pSce I-hyg共转化P．antarctica；实现了该系统在P．antarctica中的绿色荧光表达。     

亚非马蜂溶血肽基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合在昆虫细胞中的表达

构建亚非马蜂(Polisteshebraeus)溶血肽基因重组转移载体pBacHT-GFPTPhMT,转化含穿梭载体Bacmid的受体菌Escherichiacoli(DH10Bac)中,得重组穿梭载体Bacmid-GFPTPhM,再用Lipofectin介导其DNA转染粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞系Tn。SDS-PAGE分析表明,感染Bacmid-GFPTPhM的Tn-5B1-4细胞的表达产物在约为34kD处出现特异性条带,表达量约占细胞总蛋白的3%。Westernblot显示表达产物具有良好的免疫活性。感染Bacmid-GFPTPhM的细胞表达时相动态分析进一步表明,与增强型绿色荧光基因融合的亚非马蜂溶血肽基因的重组病毒已在昆虫细胞中进行了成功地表达,感染后72h表达量可达最高水平。     

绿色荧光蛋白与黄瓜花叶病毒运动蛋白融合基因的构建及在大肠杆菌中的表达

采用重组－PCR方法，扩增获得绿色荧光蛋白（GFP）与黄瓜花叶病毒运动蛋白（CMV MP）融合基因，将其克隆到pKEN上，构建了该融合基因的原核表达载体pKENG-M。SDS－PAGE及免疫印迹分析显示，57kD的融合蛋白基因在大肠杆菌DH5α中正确表达，激光共聚焦显微镜分析表明，在488nm光激发下，菌体呈亮绿色，表明融合蛋白保持绿色荧光特性。实验结果为进一步研究CMV MP的功能及其与胞间连丝和其他细胞成分的作用关系奠定了基础。     

绿色荧光蛋白的改进

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)，是细胞生物学和分子生物学研究的一个重要的工具，已得到广泛的应用。为了进一步提高GFP的利用，TFP在几个方面得到了改进：（1）基因优化，包括去除隐蔽性内含子，在隐蔽内含子的结合位点引入植物内含子，合成密码子用于优化新基因，对GFP进行环状序列改变。（2）通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温，如37℃条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性。此外，把GFP和定位序列融合，能够提高它的亚细胞定位，从而减少毒性和增加荧光。     

绿色荧光蛋白标记可移动载体质粒的构建及其在嗜水气单胞菌的表达

以多寄主可移动载体质粒ｐＳＵＰ１０１１为基础载体,构建了绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）标记的重组质粒,通过细菌接合,将重组质粒转移到嗜水气单胞菌Ｊ－１中。经紫外光检测和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析,证实重组粒在该 可表达ＧＦＰ。在无选择压力的培养条件下,２４小时后,重组质粒的稳定率在７２．２％,３６小时后,稳定率在５０％。显示ＧＦＰ作为报告基因在嗜水气单胞菌致病机理研究的应用前景。     

含有增强型绿色荧光蛋白报告子的载体系统的构建

将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体pLAFR6上,构建报告质粒pLZY。将野油菜黄单胞菌的已知效应物基因xopXccN启动子和分泌转运信号区序列克隆到pLZY,重组质粒导入野油菜黄单胞菌,阳性克隆细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光。阳性克隆接种萝卜叶片,在共聚焦激光扫描显微镜下检测观察到在植物细胞内发荧光,而含有pLZY的野油菜黄单胞菌对照菌株菌体和植物细胞内都检测不到绿色荧光,证明报告质粒pLZY工作正常。该报告质粒为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌Ⅲ型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料。     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。     

微管蛋白荧光探针的制备及其在蚕豆叶片保卫细胞中的组装

从新鲜猪脑中提取微管蛋白(两个循环的解聚甘聚合超速离心)，经DEAE-Sephadex A50离子层析纯化及罗丹明荧光标记，得到浓度为10．8mg/mL和染料蛋白比0．6(Dye／Protein=0．6)的猪脑微管蛋白荧光探针。将其显微注射于蚕豆(vicia faba L.)叶片下表皮的保卫细胞中，激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM）下观察，发现该荧光标记微管蛋白可以顺利地组装到保卫细胞的微管骨架上，5～10min即可清楚地观察到整合于保卫细胞中的微管网络。在开放气孔保卫细胞中，周质微管(cortical microtubule)沿细胞的腹壁向背壁辐射状排布；而关闭气孔保卫细胞中周质微管则解聚为零碎小片段。以上实验结果为在活体条件下，进一步精细研究气孔运动过程中保卫细胞微管骨架的动态变化提供了可靠的实验基础。     

适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用

本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子);构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因;用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍;MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近;SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究.     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

多粘类芽胞杆菌菌株M-1启动子片段的克隆及绿色荧光蛋白的表达

应用启动子探针载体pECE7,从多粘类芽胞杆菌（Panebacillus polymyxa）菌株M-1基因组克隆到一系列启动子活性片段,通过氯霉素（chloramphenicol chloromycetin,Cm）浓度梯度筛选出Cm抗性较强的3个片段。将这3个具有启动子活性的片段与来自GFP表达载体pGFP78的gfpmut3a基因插入Escherichiacoli-Bacillus穿梭载体pHY300PLY中,获得GFP表达载体pGFP5,pGFP8和pGFP17。通过热激转化E.coliDH5α,荧光显微镜下观察到明亮的绿色荧光,表明筛选到的启动子片段具有良好的启动外源基因gfp转录的功能。同时利用此表达载体标记本实验筛选得到的生防蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）菌株B905,获得了GFP标记的工程菌Bacillus cereus B905（gfp-5、gfp-8和gfp-17）,通过荧光显微镜观察,发现转入GFP表达载体pGFP5和pGFP8后,菌体有明亮的绿色荧光,而转入pGFP17的菌体荧光相对较弱。     

GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化

摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。     

红色荧光标记载体pBacA4DsRed的构建及其在蚕卵中的瞬时表达

红色荧光蛋白(RFP)是从海葵(Discosoma)中分离的一种新荧光蛋白基因,可以在紫外线激发下发出红色荧光,最大发射波长为583nm,在细胞中荧光转换效率高,是目前发现     

用绿色荧光蛋白基因（gfp）标记产酸克雷伯氏菌SG—11研究其在水稻苗期根部的定殖

本研究以自水稻根面分离的产酸克雷伯氏菌SG－11为出发菌株，分别用携带gfp和nifH-gfp的质粒转化SG－11进行基因标记，得到了转化子SG－11A和SG－11B。对两转化子的生长曲线和质粒稳定性进行了测定，在LB培养基中，SG－11的倍增时间为0.815h，对数期是3.20－5.28h，样品各点与其曲线的相关系数R^2=0.9975;SG-11A的倍增时间为1.02h，对数期是3.27－5.37h，R^2=0.9987，在无选择压力的条件下，连续传80代时质粒的保存率为0％。在K中这培养基中，SG－11的倍增时间为1.159h，对数期是2.50-4.92h，相关系数R^2=0.9922;SG-11B的倍增时间为1.163h，对数期是2.50－4.92h，相关系数R^2＝0.9698，连续转100代时质粒的保存率为65.6%。激光共聚焦显微镜观察结果表明：在试管限菌培养条件下，SG－11A主要定殖在水稻根部的伸长区和根毛区，并且在次生根形成处有菌团存在，在水稻根通气组织的细胞间隙和维管束导管内发现了SG－11A，在根的伸长区只是偶尔观察到了表达nifH-gfp的SG－11B。砂培条件下，在水稻根伸长区观察到了少量SG－11A的定殖，未检测到SG－11B。稻田土盆栽实验中，在水稻的根部既未检测到SG－11A也未检测到SG－11B。     

含绿色荧光蛋白基因与强毒部分糖蛋白B基因的马立克病毒CVI988株转移载体的构建

提取马立克病毒病毒疫苗毒株CVI988／Rispens感染的鸡（Gallus domesticus)胚成纤维细胞（CEF）的总DNA为模板，利用PCR技术扩增出病毒生长非必要的US2基因（约2.0kb)，将其克隆入T－easy载体获得载体pGUS2。用Eco R I和Bam H I消化pUR-MDVEgB质粒，回收1.8kb包含糖蛋白B（gB)基因主要抗原位点片段，插入pEGFP-C1质粒多克隆位点，构建了在CMV启动子和增强子控制下的含GFP及部分gB基因的表达盒。将此表达盒克隆入pGUS2载体US2基因中，成功地构建了含GFP及部分gB基因的转移质粒载体pEGFPgB。为其与CVI988毒株共转染CEF可获得表达GFP及强毒部分gB蛋白重组CVI988疫苗毒株打下基础。