PCR快速检测猪圆环病毒2型的方法建立及应用

根据GenBank公布的猪圆环病毒2型保守序列设计了一对引物,建立了检测猪圆环病毒2型的PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究.该PCR方法对猪圆环病毒2型扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪圆环病毒2型检测的灵敏性为1pg总DNA量.结果表明,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪圆环病毒2型的早期确诊和病毒鉴定.     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

摘要:本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

猪圆环2型病毒环介导等温扩增实时检测方法的建立与评价

以猪圆环2型病毒为材料,设计了2对引物,构建了猪圆环2型病毒实时环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环2型病毒实时LAMP检测方法,通过应用实时浊度仪可以对猪圆环2型病毒进行快速检测。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立与应用

以猪圆环病毒2型为材料,设计了3对引物,构建了猪圆环病毒2型环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环病毒2型的LAMP检测方法,可以采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成的沉淀等现象判定反应结果,为猪圆环病毒2型的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法,可以满足现场检疫的需要。     

多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列,利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计,选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示,该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng,而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性,作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。     

猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立

根据GenBank中20株猪圆环病毒（PCV2）核苷酸序列设计两对引物，建立的检测猪圆环病毒的多重PCR方法，其中引物P1、P2为PCV特异性，扩增938bp片段。P3、P4为PCV2特异性扩增490bp，因此本方法不仅可以扩增PCV片段，还可以同时区分PCV1和PCV2。该方法具有良好的特异性和敏感性，为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础。     

检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。     

猪肺炎支原体巢式PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种快速诊断猪肺炎支原体病原的方法,根据GenBank上登录的Mhp基因组序列,在保守区基因内部设计合成2对引物,经过PCR反应条件的优化,建立了检测猪肺炎支原体的巢式PCR方法。结果表明,该方法对鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;第1次扩增的敏感性是10pg,第2次扩增的敏感性是0.1pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。巢式PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以在短时间内准确快速的检测出低含量的Mhp病原,为猪肺炎支原体的快速诊断与净化奠定基础。     

PRV、POV-2、PPV多重POR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪Ⅱ型圆环病毒（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的,临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

猪博卡病毒1型/2型PCR检测方法的建立

猪博卡病毒(PBo V)是2009年新发现的一种DNA病毒,常于腹泻仔猪体内检测到该病毒。为建立该病毒的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的PBo V 1/2型的高度同源保守序列设计一对特异性引物,经PCR扩增条件优化,建立了PBo V 1/2型的PCR检测方法。特异性试验结果显示,该PCR方法仅从PBo V 1或2型的阳性病料样品中特异性的扩增出751 bp的目的片段,而对猪伪狂犬病毒、圆环病毒、大肠杆菌、沙门氏菌的核酸样品的扩增结果均为阴性。敏感性试验显示,该PCR方法对PBo V 1/2重组质粒标准品的最低检测量为34.8拷贝/μL。对来自河南中牟、开封、兰考、濮阳、洛阳等地猪场发生腹泻疫情的70份猪病料样品,采用该方法进行检测,其中10份样品呈PBo V 1/2型阳性,阳性率为14.29%。该PCR检测方法的建立为PBo V1/2型的诊断和监测提供技术支持。     

PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

貂圆环病毒PCR检测方法的建立

根据本实验室获得的貂圆环病毒Cap基因序列设计了1对特异性引物,建立了PCR检测方法。利用该方法对猪细小病毒、貂肠炎病毒、犬细小病毒、猪圆环病毒、貂阿留申病毒,大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性实验表明,该方法最低能检测到病毒核酸量为10μg/L。利用所建立的PCR方法检测采自大连的72份样品,结果阳性率为59.7%,表明貂圆环病毒在大连水貂养殖场的感染率较高。     

乙型脑炎病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种快速的乙型脑炎病毒(JEV)病原检测方法,根据GenBank上登录的JEV基因组序列,设计合成内外2对引物,优化PCR反应条件,建立了检测JEV的套式RT-PCR方法。结果:该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。研究表明建立的套式RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性,可以准确快速检测出极低含量的JEV,将为JEV感染的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的检测方法。     

猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪博卡病毒(PBoV)3/4/5型的双重PCR方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ORF1基因序列和PBoV不同基因型VP1序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测PEDV和PBoV3/4/5型双重PCR方法,特异性检测结果显示该方法对猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对PEDV和PBoV3/4/5型重组质粒标准品的最低检出量分别为837拷贝/μL和1 000拷贝/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出PEDV和PBoV3/4/5型混合感染及单独感染。本研究建立的双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的检测

为了检测猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的情况,研究建立了快速,简便,灵敏度高,特异性强的鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪博卡病毒(PBoV)的双重检测方法。针对PRV gE基因和PBoV NS1基因的序列,分别设计了2对特异性引物,通过对引物浓度、模板加入量、退火温度等的优化,建立了快速鉴别PRV和PBoV的双重PCR检测方法,并进行了特异性和敏感性试验。特异性试验表明,该方法可以扩增出PRV gE长度为316 bp和PBoV NS1长度为996 bp的目的片段,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪捷申病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无扩增;敏感性试验表明,PRV、PBoV的最低核酸检出量分别为6.44×10~2拷贝和9.51×10~3拷贝,与单一PCR敏感性相同。应用该方法对49份送检病料样品进行检测,其中PRV和PBoV的单纯感染检出率分别为34.69%和14.28%,混合感染检出率为8.16%,与单一PCR检测结果符合率为93.88%。     

猪伪狂犬病病毒野毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。     

基于猪伪狂犬病毒gE基因的PCR法快速诊断猪伪狂犬病的研究

为了建立一种快速检测猪伪狂犬病毒(PRV)的方法,试验采用PCR法,并以NCBI公布的PRV Min-A株(登录号为AY170318.1)的gE基因序列为参考序列设计1对特异性引物,进行PRV基因的扩增,并对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果表明:该PCR检测方法扩增的目的基因长348 bp;应用此方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)进行PCR扩增均未有条带出现;该方法能够检测到的最低DNA模板量为10 pg;重复性良好;应用此法对43份临床样品进行检测,检出率为65.12%(28/43)。说明该PCR检测方法可用于PRV的分离鉴定、临床病料检测和分子流行病学调查等。