酶免法检测普氏野马粪便性类固醇激素的最佳稀释比例

甲醇对粪便性类固醇激素的检测有一定的影响,为了确定应用酶联免疫方法(酶免法)检测普氏野马粪便性激素的最佳稀释比例,对甲醇保存的提取样品在检测前用PBS缓冲液进行一定比例的稀释。结果显示:检测孕酮(P),样本稀释15倍时;检测睾酮(T),样本稀释15倍时;检测雌二醇(E2),样本稀释30~50倍时,酶标抗原的结合率(B/B0)接近50%,意味着50%的包被抗体被酶标抗原结合,此时的检测结果较灵敏。     

三唑磷酶联免疫吸附测定法中包被抗体稳定剂的研究

选择了甘油、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、卵清蛋白(OVA)、多肽、糖、氨基酸等试剂,通过经验法和正交法相结合的手段配制了一系列稳定剂,对吸附在酶标板上的三唑磷多克隆抗体进行处理(37℃,1 h)后,再在37℃下连续贮存 7 d,利用直接竞争ELISA法对不同稳定剂处理的包被抗体免疫活性、亲合性及检测灵敏度进行检测,并与未经稳定剂处理的对照进行比较,筛选得到效果较好的稳定剂 1 (质量分数:甘油2.5%,氨基酸1.5%,蛋白胨3.0%,离子螯合剂0.1%,防腐剂0.01%)。用稳定剂 1 处理包被抗体后,4~6℃下保存半年及37℃下保存14 d的试验结果表明,抗体的活性相对保持率分别为97.8%和94.2%;其免疫活性、亲合性(I50分别为68.43和54.38 ng/mL)及灵敏度(I10分别为3.72和 3.22 ng/mL)与常规方法包被的抗体(包被好后不贮存,直接检测,I50为60.73 ng/mL,I10为 3.11 ng/mL)无明显差异;冻融试验表明,经稳定剂 1 处理的三唑磷抗体在反复冻-融次数不超过8次时其活性也是稳定的。说明筛选出的稳定剂可以显著提高三唑磷多克隆包被抗体的稳定性,可用于三唑磷ELISA试剂盒的生产。     

氯噻啉酶联免疫分析方法研究

建立了基于多克隆抗体的氯噻啉间接竞争酶联免疫分析(ic-ELISA)方法。设计合成了氯噻啉半抗原,将其分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫原和包被原。用免疫原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体效价为2.56×106。通过对有机溶剂含量、离子强度和pH等影响因素的优化,确定了氯噻啉ic-ELISA的最佳检测条件(含体积分数10%甲醇的磷酸盐缓冲液、Na+浓度为0.14 mol/L、 pH 7.4),并建立了氯噻啉标准竞争曲线,该方法的抑制中浓度(IC50)为0.18 mg/L,最低检测限(IC10)为0.001 8 mg/L。所得多克隆抗体除与吡虫啉有较大的交叉反应外,与其他结构相似的化合物无明显交叉反应。在水、土壤和甘蓝中分别添加0.05~1 mg/kg的氯噻啉标准溶液,平均回收率为91.42% ~113.82%,相对标准偏差(RSD)为0.72% ~8.68%,符合农药残留检测要求。该ELISA方法可用于环境及农产品中氯噻啉残留检测。     

花生植株、籽粒及田间土壤氟磺胺草醚残留分析方法研究

在前人研究基础上, 确立了花生植株以甲醇、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和石墨化炭黑（GCB）为基质分散萃取材料, 花生籽粒和田间土壤分别以酸化甲醇和乙腈为分散萃取溶剂, 以PSA为基质净化材料的3类氟磺胺草醚残留样品前处理程序, 建立并优化了花生籽粒、花生植株和田间土壤氟磺胺草醚残留高效液相色谱检测方法。结果显示, 氟磺胺草醚在0.05~10.0 mg/L质量浓度范围内与对应色谱峰积分面积线性响应良好, 回归方程为 y =2.562 8x -0. 006 8（r 2=0.999 8）。在0.05 ~0.5 mg/kg氟磺胺草醚添加范围内, 花生籽粒、植株和田间土壤中的平均回收率为85.6%~113.5%, 相对标准偏差为1.5%~9.7%。花生植株、籽粒和田间土壤中氟磺胺草醚的检出限分别为0.024、0.029和0.031 mg/kg。基质效应试验结果表明, 该样品前处理方法获得的分析样品基质效应不明显, 表明该残留样本前处理方法和样品检测方法简便、高效、经济、可靠, 可满足氟磺胺草醚在花生植株、籽粒及田间土壤中残留的定量检测要求。     

对硫磷ELISA异源分析模式比较研究

为探讨方法模式对异源ELISA法各分析参数的影响情况及影响机理,设计并合成了4种与对硫磷结构相似的竞争半抗原,通过建立不同模式的同源与异源ELISA分析法,比较了不同模式下的抗原抗体用量、灵敏度、检测限及不同样品添加回收率。结果表明,异源分析对抗原和抗体的用量比同源分析有所增加,但异源分析可大大提高方法的检测灵敏度。在异源分析中,直接竞争包被抗原的ELISA(CC模式)方法重现性较差;直接竞争包被抗体的ELISA(AC模式)抗原抗体用量最多,检测灵敏度较低;间接竞争ELISA法(IC模式)具有较好的检测灵敏度,抗环境和基质干扰的能力较强,为异源ELISA分析中较优的模式。     

拟除虫菊酯类农药酶免疫分析方法研究进展

对拟除虫菊酯类单一农药残留和多残留酶免疫分析方法的研究进展进行了综述。在介绍单一农药残留酶免疫分析方法中半抗原分子设计和ELISA方法建立的基础上,指出刚性连接臂是菊酯类农药免疫半抗原分子设计的一般原则,包被原和免疫原采用不同的载体蛋白和不同结构的半抗原有利于菊酯类农药ELISA方法的建立。在介绍菊酯类农药多残留酶免疫分析方法时,剖析了通用免疫半抗原的结构特点,阐述了宽谱特异性抗体的筛选方法,揭示了在菊酯类农药多残留酶免疫分析法中存在竞争半抗原的选择具有盲目性、宽谱特异性抗体对不同农药的特异性差异较大的问题。并对拟除虫菊酯类农药通用免疫半抗原设计及多残留酶免疫分析技术的发展趋势进行了探讨。     

酶联免疫吸附法(ELISA)检测花生种子带毒的研究

 利用花生上分离到的花生轻斑驳病毒(PMMV),黄瓜花叶病毒CA株系(CMV-CA),花生矮化病毒Mi株系(PSV-Mi)所制备的抗血清,从中提取IgG、应用ELISA间接法检测花生种子,在花生种子中不程度地都检测出带有PMMV、CMV、PSV病毒,而且有复合带毒现象。经催芽的花生种子子叶、胚芽及胚根分别用PMMV和CMV免疫制备的抗体进行检测,花生的上述三部分均带有PMMV和CMV病毒,且胚芽中病毒量最高。萌发种子及未萌发种子的子叶无论从带毒率还是病毒含量上均看不出明显的差异。ELISA间接法由于直接利用商品酶标抗体,简化了试验程序,利于对种子带毒进行快速检测。     

A 蛋白酶联法检测植物病毒的研究

用一种动物的特异抗体,与市售 A 蛋白(SPA)、A 蛋白酶标记物(HRP-SPA)组合成 A 蛋白酶联免疫吸附试验(SPA-ELISA)检测南方菜豆花叶病毒(SBMV)、烟草花叶病毒(TMV)纯化抗原和病株粗澄清液,灵敏度分别为0.128μg/ml 和1:10000。使用的 A 蛋白包被的适宜工作浓度为2.5μg/ml,兔抗 SBMV 血清作第一抗体适宜工作浓度为1:100000,作第二抗体适宜工作浓度为1:1000。检测 TMV 也得到相似的结果。该法的灵敏度是 ELISA-异种动物抗体双夹心法的1～25倍;是 ELISA 间接法的10～125倍;是免疫双扩散法的3000～6000倍。应用这种酶联法既不需要纯化抗体、也不要自己制备酶标记抗体,又不需要制备第二种动物特异抗体就可以得到酶联双抗体夹心法和异种动物抗体双夹心法相似或更好的结果,使 ELISA 更适于在植物检疫上推广应用。     

化学发光酶免疫分析法检测黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留

为实现黄瓜、青菜和水样品中噻虫嗪残留的灵敏、快速检测，本文开展了噻虫嗪残留化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)研究。通过优化抗原和抗体工作浓度，分析体系中封闭物种类、甲醇含量、钠离子浓度及pH值，建立了噻虫嗪化学发光酶免疫分析方法。在最优分析条件下，该方法的线性范围为0.125～12.5 ng/mL，定量限(LOQ)为0.125 ng/mL,IC₅₀值为1.01 ng/mL。7种噻虫嗪类似物的交叉反应率均不高于0.3%，特异性较好。分别以黄瓜、青菜和池塘水为对象开展添加回收试验，添加回收率范围为86%～108%，相对标准偏差(RSD)为2.6%～9.1%，与超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLCMS/MS)分析结果一致。采用该方法对市场购买的黄瓜、青菜和池塘水中的噻虫嗪残留进行检测，最终3种样品中噻虫嗪残留均低于检出限。研究结果表明，该CLEIA方法灵敏度高，样品前处理简单，环境友好，能够满足黄瓜、青菜和水中的噻虫嗪残留检测。     

ELIA—异种动物抗体双夹心法检测玉米细菌性枯萎菌的研究

前言酶联免疫吸附技术(Enzyme Linked Immunosorbent assay简称ELISA)自1976年在植物界问事以来,已获得日益广泛的应用,方法也逐渐改进和完善,充分体现出它灵敏度高、特异性强、快速、准确之优越性。本试验试图利用同种抗原免疫两种动物制备特异抗体,和市售优质廉价的酶标记物合组ELISA-异种动物抗体双夹心试验,既保持双抗体法灵敏度高、特异性强的特点,又省去制备标记抗体的烦琐手续,也降低了成本,使ELISA检测技术更易于推广应用。     

稻谷加工过程中4种常用杀虫剂残留的消解规律

为控制水稻籽粒中农药的残留量,提高稻米食用的安全性,研究了稻谷中三唑磷、毒死蜱、丁硫克百威和氯虫苯甲酰胺4种杀虫剂从农田到餐桌的残留消解规律,阐明了水稻生长后期4种农药的施药期、用药量、采收间隔期与籽粒中农药残留分布的关系,并结合食用加工过程,分析了稻米入口前农药的残留消解情况,评估了稻米食用的安全性。田间试验参照农药登记残留试验准则进行,采用液相色谱-串联质谱法测定4种农药在稻谷不同加工过种中的残留量。结果表明:脱壳和碾米2种稻谷加工过程对4种农药的去除具有促进作用,其加工因子 (P_F) 均小于0.5;稻米食用加工过程中淘洗2次结合高压蒸煮可有效降低4种农药在稻米中的残留量,P_F<0.2,可进一步提高农药摄入的安全性。农药种类、施药剂量与采收间隔期和稻米的安全性密切相关。氯虫苯甲酰胺和丁硫克百威主要分布在稻壳和谷糠中,两者占总含量的85%以上,因此即使蜡熟期施药1次,采收间隔期21 d,2种农药也均未检出;而毒死蜱和三唑磷在收获后的籽粒中仍有检出,残留量范围分别为0.032~0.043 mg/kg和0.053~0.073 mg/kg。精米中三唑磷含量分配比随采收间隔期延长先降低后增加,其累积具有显著的滞后性,使得三唑磷残留量高于中国国家标准中规定的最大残留限量 (MRL) 0.05 mg/kg,应适当延长采收间隔期以降低其最终残留量。即使在乳熟期施药,所有剂量处理收获后的大米经淘洗2次结合高压蒸煮后,4种农药的残留水平均低于MRL值。因此,适当的食用加工方式能够有效降低稻米中农药的残留量,提高稻米食用的安全性。     

Triazophos resistance mechanisms in the rice stem borer (Chilo suppressalis Walker)

A field population of the rice stem borer (Chilo suppressalis Walker) with 203.3-fold resistance to triazophos was collected. After 8-generation of continuous selection with triazophos in laboratory, resistance increased to 787.2-fold, and at the same time, the resistance to isocarbophos and methamidophos was also enhanced by 1.9- and 1.4-fold, respectively, implying some cross-resistance between triazophos and these two organophosphate insecticides. Resistance to abamectin was slightly enhanced by triazophos selection, and fipronil and methomyl decreased. Synergism experiments in vivo with TPP, PBO, and DEM were performed to gain a potential indication of roles of detoxicating enzymes in triazophos resistance. The synergism results revealed that TPP (SR, 1.92) and PBO (SR 1.63) had significant synergistic effects on triazophos in resistant rice borers. While DEM (SR 0.83) showed no effects. Assays of enzyme activity in vitro demonstrated that the resistant strain had higher activity of esterase and microsomal O-demethylase than the susceptible strain (1.20- and 1.30-fold, respectively). For glutathione S-transferase activity, no difference was found between the resistant and the susceptible strain when DCNB was used as substrate. However, 1.28-fold higher activity was observed in the resistant strain when CDNB was used. These results showed that esterase and microsomal-O-demethylase play some roles in the resistance. Some iso-enzyme of glutathione S-transferase may involve in the resistance to other insecticides, for this resistant strain was selected from a field population with multiple resistance background. Acetylcholinesterase as the triazophos target was also compared. The results revealed significant differences between the resistant and susceptible strain. The V_max and K_m of the enzyme in resistant strain was only 32 and 65% that in the susceptible strain, respectively. Inhibition tests in vitro showed that I₅₀ of triazophos on AChE of the resistant strain was 2.52-fold higher. Therefore, insensitive AChE may also involved in triazophos resistance mechanism of rice stem borer.     

三唑磷对麦穗鱼脑组织中乙酰胆碱酯酶的诱导

为了检测有机磷杀虫剂对鱼脑组织中乙酰胆碱酯酶(AChE, EC 3.1.1.7)的诱导,采用间接非竞争酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测了三唑磷胁迫下麦穗鱼Pseudorasbora parva脑组织中乙酰胆碱酯酶含量的变化。当暴露浓度仅为0.1 μg /L时,三唑磷即对AChE产生诱导。由于存在诱导效应,三唑磷对酶活性的抑制在一定程度上被酶蛋白含量的提高所掩盖。研究结果表明,以酶蛋白替代总蛋白来衡量粗酶液中AChE的活性,可以明显提高对有机磷胁迫作用的检测灵敏度。     

应用单克隆抗体检测香蕉束顶病

应用香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ）的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）建立了检测香蕉束顶病的间接ＥＬＩＳＡ方法，其检测香蕉病组织汁液的最大稀释度为１：１２８０，健康香蕉组织汁液无非特异性反应。用间接ＥＬＩＳＡ方法检测了采自广东、广西９个市（县）的香蕉产区的８０个大田香蕉束顶病样本和２５个荫棚香蕉试管苗样本，其中大田样本ＢＢＴＶ的带毒率为７６．５％，试管苗样本的带毒率为８．０％。香蕉束顶病株不同部位ＢＢＴＶ含量检测表     

Monoclonal antibody for the detection and identification of a phytoplasma associated with rice yellow dwarf

One stable hybridoma clone, 247B11, secreting specific monoclonal antibody (MA) against the mycoplasmalike organism (MLO), newly be termed phytoplasma, associated with rice yellow dwarf (RYD) was produced by employing an immunization scheme for inducing the immunological tolerance of mice to rice antigens prior to the administration of RYD-phytoplasma immunogens. Neonatal BALB/c mice were first injected with nontarget rice antigens present in the immunogen preparation and were immunized intrasplenically with RYD-phytoplasmaenriched antigens prepared by Percoll density-gradient fraction 6 wk later. The MA was of the IgG1 class. With this MA, RYD-phytoplasma in diseased rice was specifically detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescent staining and tissue-blotting techniques. Antibody titer determined by indirect ELISA for hybridoma-culture supernatant was 5120. The antibody recognized two polypeptides, 16 kDa and 41 kDa of RYD-phytoplasma determined by western blotting. RYD-phytoplasma was differentiated serologically from the phytoplasmas associated with sweetpotato, peanut, loofah, paulownia, andIpomoea obscura witches' broom, aster yellows (NJ strain), elm yellows, and sugarcane white leaf both in indirect ELISA and immunofluorescent staining.     

Evaluation of an enzyme immunoassay for the detection of the insect growth regulator fenoxycarb in environmental and biological samples

A competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for fenoxycarb was adapted for quantitative detection of this insect growth regulator in various environmental, agricultural, food and biological matrices. Environmental samples were taken from soil and surface waters in Hungary. The ELISA enabled fenoxycarb detection in surface waters in the 1.1-125 ng ml(-1) concentration range without sample cleanup. In contrast, soil produced a strong matrix effect due to humic acids and other soil components. Several fruit homogenates and commercial fruit juices (eg apple, pear, grape) were analyzed by the ELISA. The assay was found to be suitable for analysis of fenoxycarb in fruit juices diluted 1:40. Biological samples included insect, fish and bovine tissues. The ELISA was applied to detect fenoxycarb in various biological matrices from larvae of the silkworm, Bombyx mori L. The assay proved useful for the analysis of haemolymph diluted 1:10 or at higher dilutions. Fat body and whole body homogenates, however, caused severe matrix effects. Fenoxycarb was detected in liver homogenates (diluted 1:40) from fish treated with various doses of fenoxycarb, and the concentrations determined correlated with the applied doses. The method was used to analyze spiked bovine urine samples diluted 1:10 or at greater dilutions. Fenoxycarb content determined by the ELISA in water and fruit juice samples was validated using GC-MS with solid-phase microextraction (SPME) sample preparation. The results of these studies demonstrated both the value and limitations of the assay when used for monitoring fenoxycarb in environmental, food and biological samples.     

稻田中华稻蝗发生动态、危害损失及防治指标

系统地研究了中华稻蝗发生动态与危害损失。结果表明,中华稻蝗在浙江年发生1代,主要危害早稻和早播单季晚稻。水稻分蘖期接入虫量10～50头/m2,叶被害率为52.61%～78.81%,叶被害指数为14.51～25.00,产量损失率为2.31%～27.42%,孕穗至破口期接入虫量1～17头/m2,叶被害率为56.63%～88.00%,叶被害指数为14.69～31.32,产量损失率为1.28%～32.74%,随着虫口密度增加,危害程度上升,产量损失率加大,两者具有密切相关性,建立了危害损失关系式。水稻叶片受害、光合能力减弱、幼穗分化不良、实粒减少、秕谷增加和粒重下降是导致水稻减产的主要原因。模拟测试表明,随着水稻受害生育期推迟损失增大,且分蘖期危害具有一定的补偿能力。在现有生产条件下,经济允许损失水平为2.5%～3.0%;2～3龄蝗蝻为防治适期,氟虫腈、三唑磷等有较好防治效果。提出水稻分蘖期和孕穗至破口期防治指标分别为10头/m2和5头/m2。     

香蕉花叶病的酶联免疫检测技术研究

 用分离自香蕉病株的黄瓜花叶病毒香蕉毒株(CMV-B)和烟草花叶病毒香蕉毒株(TMV-B)制备抗血清,其效价As-CMV-B为1:5000,As-TMV-B为1:8000。用这两种抗血清检测香蕉花叶病,间接ELISA和PAS-ELISA法可检测香蕉病叶汁液的最大稀释度均为1:1280,健叶汁液无非特异性反应,Dot-ELISA可检测病叶汁液的最大稀释度为1:640,健叶汁液在稀释度为1:20时有轻度非特异性反应。用间接ELISA法检测了田间香蕉病株和香蕉试管苗标样共158份,其中CMV的带毒率为58%,TMV的带毒率为19%,二者复合感染率为8.5%。     

施药因子对三唑磷在水稻上残留沉积的影响

采用室内模拟试验方法,研究了施药剂量、稀释倍数、施药次数、剂型、施药时期对三唑磷在水稻上原始沉积的影响,并通过套袋处理探讨了穗期施药对糙米中三唑磷最终残留量的影响。结果表明,三唑磷的原始沉积量与施药剂量呈线性正相关关系,与稀释倍数呈线性负相关关系,线性方程分别为:y=0.883 1+0.352 7x( r=0.982 2)和y=110.21-0.200 5x(r=0.986 2),施药次数与三唑磷残留量呈正相关;于穗期施药后,未套袋处理糙米中三唑磷的残留量显著高于套袋处理。明确了田间施药过程中影响三唑磷在水稻上原始沉积量的主要因子为施药剂量、施药次数和稀释倍数,探明了套袋处理能有效降低糙米和谷壳中三唑磷的残留量,可为科学合理施药以有效降低农药残留提供参考。     

香蕉—水稻轮作联合添加有机物料防控香蕉枯萎病研究

香蕉枯萎病是一种由尖孢镰刀菌引起的土传病害, 枯萎病的发生对香蕉产业造成严重的冲击本文针对香蕉枯萎病难以防控的难题, 采用水稻轮作同时添加有机物料（椰糠、稻秆和桉树皮）的方法, 研究了其对香蕉枯萎病高发病蕉园土壤中尖孢镰刀菌(FOC)和其他微生物数量的影响及其对香蕉枯萎病的防控效果。结果表明, 轮作水稻可以显著减少土壤中FOC的数量, 从而降低香蕉枯萎病的发病率。其中轮作水稻处理比未淹水未种植水稻处理FOC的数量下降了71.5%, 下茬香蕉枯萎病发病率降低了81.7%; 与未种植水稻但淹水的处理相比FOC数量下降了47.8%, 下茬香蕉枯萎病发病率降低了71.2%; 种植水稻同时添加水稻秸秆能够显著增强病原菌的杀灭效果和对下茬香蕉枯萎病的防控效果, 相比未添加物料轮作水稻处理, 尖孢镰刀菌数量下降了36.2%, 下茬香蕉枯萎病发病率降低了50.0%。同时, 水稻轮作同时添加有机物料处理及其下茬香蕉的种植, 对土壤中可培养细菌、真菌和放线菌数量均具有不同的影响。其中水稻种植期间不同处理的可培养真菌与放线菌数量随着时间的增加整体呈下降趋势, 而在种植香蕉后随时间的增加呈上升趋势; 土壤中可培养细菌的数量在水稻种植与香蕉种植期间随着时间的增加未呈现出规律性。结论：水稻轮作联合稻秆的添加能有效降低土壤中FOC的数量和下茬香蕉枯萎病的发病率。