猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量的研究

为了确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)的最小免疫剂量,本研究将3批猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)分别稀释成10TCID_(50)/mL、102.0TCID_(50)/mL、103.0TCID_(50)/mL,每批疫苗各个稀释度分别免疫仔猪1.0 mL/头,并设攻毒对照组和阴性对照组。免后10 d连同攻毒对照组用伪狂犬病病毒GD1株进行攻毒保护试验,阴性对照组不攻毒。结果表明,10TCID_(50)/头和102.0TCID_(50)/头的免疫剂量在免疫后10 d依然无法提供完全的免疫保护,保护率为20%～80%(1/5～4/5);103.0TCID_(50)/头的免疫剂量能够保护仔猪抵抗PRV强毒的攻击,保护率为100%(5/5);攻毒对照组发病率为100%(5/5),死亡率为80%(4/5);阴性对照组全部健活。由此确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量为103.0TCID_(50)/头。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)免疫产生期和免疫持续期的研究

为评价猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)的免疫保护效力,本研究对3批疫苗分别进行免疫产生期试验和免疫持续期试验。免疫产生期试验中将3批疫苗以单剂量免疫仔猪,在免疫后2、3、4、5、6 d连同对照组分别攻击伪狂犬病强毒,结果表明猪伪狂犬病活疫苗免后5 d即可产生坚强的免疫保护力。免疫持续期试验中将3批疫苗以单剂量免疫母猪,免疫后12、14个月连同对照猪分别攻击伪狂犬病强毒,结果显示免疫母猪及其所产仔猪均健康存活,表明猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)的免疫持续期可长达14个月。     

ST传代细胞源猪伪狂犬病毒活疫苗(Bartha-K61株)超剂量免疫的安全性实验

ST传代细胞生产3批次伪狂犬病毒活疫苗(Bartha-K61株)中试产品,检验合格后对20~25日龄、50~55日龄健康猪以及妊娠后期的母猪,分别采用耳后颈部肌肉注射方式进行超剂量免疫接种,同时设立相应对照组。超剂量免疫后各组猪只精神、食欲、体温、生产状况等经持续观察记录,均表现为正常。结果表明,ST传代细胞生产猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)对不同日龄猪和妊娠后期母猪进行超剂量免疫接种均是安全的。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)后,抵抗伪狂犬病病毒(PRV)变异株攻击的保护效果。取4~6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株(AH02LA株)攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明:伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。     

伪狂犬病病毒TK、gE双基因缺失传代致弱株的安全性及免疫效力研究

为获得安全、有效的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株弱毒疫苗，在前期研究的基础上，对PRV变异株TK、gE双基因缺失株(PRV LA1206株)进行传代致弱，在鸡胚成纤维细胞上连续传代75次，后经连续5代挑取单个病毒蚀斑克隆而得F₈₀代，毒种命名为PRV LA1206-80株，并对其进行安全性及免疫效力评价。生长动力学试验结果显示，PRV LA1206-80株与PRV LA1206株生长动力学相似。仔猪安全性试验结果显示，滴鼻接种1日龄PRV抗体阴性仔猪后所有仔猪均未出现发热及临床症状，表明该毒株对1日龄仔猪安全。攻毒保护试验结果显示，28～35日龄仔猪肌肉注射接种PRV LA1206-80株或PRV LA1206株7 d后进行变异株PRV AH02LA株滴鼻攻毒，可产生良好保护，所有仔猪均未出现体温反应、临床症状和排毒。而PRV Bartha K61株免疫猪7 d后攻毒，均出现了体温反应，其中1头发病，且鼻拭子样品均检出病毒。综上所述，相较于PRV LA1206株，在鸡胚成纤维细胞上连续传代后获得的PRV LA1206-80株已...     

猪伪狂犬病病毒HNX株在免疫猪群中水平传播能力的研究

为研究猪伪狂犬病病毒(PRV)HNX株水平传播的能力及PRV活疫苗的保护效力,本研究通过以颈部肌肉接种PRV HNX株(2 m L 107 TCID50)的未免疫猪作为病毒的传染源,同居感染未免疫猪和Bartha-K61株活疫苗免疫猪,通过检测抗PRV的g B和g E蛋白抗体、中和抗体及干扰素水平等评估疫苗保护力,并利用荧光定量PCR方法检测同居感染猪排毒情况。结果显示Bartha-K61株活疫苗能够快速诱导免疫猪产生抗g B蛋白的抗体,但疫苗诱导产生的交叉保护中和抗体水平较低。同居感染期间,免疫猪和未免疫猪均出现典型的临床症状,体温明显升高。荧光定量PCR方法结果显示,疫苗免疫能够减少免疫猪排毒,但不能阻止排毒,也不能阻止野毒感染。本研究结果表明Bartha-K61株活疫苗阻止PRV HNX株水平传播的效力是有限的,有必要更换疫苗病毒株。同居感染期间,每组感染猪均表现敏感,表明PRV HNX株病毒具有较强的水平传播能力。     

猪伪狂犬病病毒高免血清的制备及应用

用伪狂犬病病毒及抗体阴性羊,以不同免疫剂量,间隔一定时间,多次免疫不同类型的猪伪狂犬病病毒(Bartha-K61株),制备猪伪狂犬病病毒高免血清,特异性强,效价可达1:2 048以上。本研究为伪狂犬病活疫苗或毒种的鉴定及外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清。     

猪伪狂犬病病毒灭活疫苗对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株的免疫保护效果评估

为评估猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）免疫后对PRV流行毒株和经典毒株的保护效果,本研究对试验猪分别免疫PRV灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）和PRV活疫苗（Bartha-K61）,免疫后第0、7、10、14、17、21、24和28天采血测定PRV gB抗体,并分别使用PRV流行毒株HN1201株和经典毒株闽A株测定免疫后第0、7、14、21和28天血清的中和抗体水平,于免疫后第28天分别使用HN1201株和闽A株攻毒并观察,之后测定体温,测定攻毒后第7和14天PRV gE抗体,及攻毒后0~8 d的排毒情况。结果显示,HN1201-ΔgE免疫组较Bartha-K61免疫组gB抗体和中和抗体产生早,且抗体水平较高。两个免疫组试验猪在攻毒后虽然均无明显临床症状,且免疫组织化学检测（IHC）组织中的病毒抗原均为阴性,但HN1201-ΔgE免疫组试验猪脏器未见任何病理损伤,Bartha-K61免疫组试验猪部分脏器具有病理损伤。与未免疫对照组相比,2个免疫组试验猪在HN1201株和闽A株攻毒后,gE抗体转阳时间晚且排毒率低,HN1201-ΔgE免疫组gE抗体水平整体均低于Bartha-K61免疫组,攻毒后排毒检测中,Bartha-K61免疫组于2个毒株攻毒后第3~5天可检测到排毒,而HN1201-ΔgE免疫组全程未检测到排毒。研究结果表明,灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）对PRV流行毒株和经典毒株均可提供完全保护。     

猪源伪狂犬病病毒传代致弱LA2017株的安全性和免疫效力研究

为检测猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株作为疫苗后选株的安全性及免疫效力。本研究对4日龄初生仔猪和产前1个月妊娠母猪免疫LA2017株后的安全性、28～35日龄仔猪免疫效力以及免疫猪后排毒和同群传播性进行了研究。结果显示:滴鼻接种4日龄仔猪和肌肉注射产前1个月的妊娠母猪,均无任何临床症状,表明该疫苗株具有良好的安全性;肌肉注射接种28～35日龄的仔猪,免疫后7 d产生对PRV变异株AH02LA的完全保护并且可以阻止排毒,免疫14 d后攻毒均未发病和排毒,而PRV Bartha K61株免疫猪后7 d攻毒,有4头猪出现了体温升高,鼻拭子样品均检出病毒,免疫后14 d和21 d时对试验猪攻毒,PRV Bartha K61株免疫组均有猪发病,且鼻拭子样品均检出病毒;在抗体产生水平方面,PRV LA2017株免疫后14 d产生高水平中和抗体,PRV中和指数抗体≥10 000,且维持至免疫后5个月,而Batha-K61组免疫后1个月至3个月针对PRV变异株AH02LA的中和指数仅为178～1000,且4个月就开始下降;在同群感染方面,PRV LA2017株肌肉注射接种28～35日龄仔猪后14 d内均未从鼻拭子和肛门拭子检出排毒,gB抗体全部转为阳性,同群非免疫接种猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性,表明PRV LA2017株安全性好,无横向传播,不引起同群感染。结果表明,PRV LA2017株作为疫苗株对猪伪狂犬变异株的保护效果显著优于Bartha K61株,该毒株安全性好、抗体水平高和持续时间长,是一株极具开发价值的猪伪狂犬病流行株的弱毒疫苗候选株。     

执着创新 缔造百年永顺

正2008年,广东永顺生物制药股份有限公司(以下简称永顺生物)和中国兽医药品监察所共同研发的ST猪瘟活疫苗(传代细胞源)上市。经过十余年刻苦努力研发,2018年7月,永顺生物ST传代细胞源家族迎来了新的成员—猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)获得了新兽药证书,将为养猪场提供预防     

山东省某规模猪场猪伪狂犬病毒变异毒株的分离与鉴定

2015年山东省烟台市某免疫伪狂犬病疫苗Bartha-K61猪场暴发疑似伪狂犬病疫情,临床表现为妊娠母猪繁殖障碍,仔猪神经症状。脑组织病料样品接种BHK21细胞,分离获得1株伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-YT株。该病毒株gE基因与JS-2012、HN1201和ZJ01株序列同源性为99.4%～99.8%,且位于同一遗传进化分支。选择70日龄PRV阴性健康猪接种PRV-YT株,发病率和死亡率均达100%(5/5),均表现严重脑组织、肝脏与肺脏损伤,表明PRV-YT株为猪伪狂犬病病毒变异强毒株。本研究为制定猪伪狂犬病防控方案提供了重要基础。     

猪伪狂犬病病毒HDDJ株的分离鉴定

广东省某猪场常规免疫猪伪狂犬病疫苗(Bartha-K61株)的母猪流产,疑似为猪伪狂犬病病毒感染。为确定发病原因,将流产胎儿的脑、淋巴结、肺脏研磨混合液接种Vero细胞,形成稳定细胞病变(CPE),并测定其细胞半数感染量(TCID50),通过PCR鉴定、测序比对、进化树分析,确定感染病毒及基因型,动物回归实验判定病毒致病性。结果表明,分离毒株为PRV中国变异株,命名为HDDJ株,与猪伪狂犬病疫苗Bartha-K61株亲缘关系较远。     

猪伪狂犬病毒变异株(Fujian-LY)对免疫仔猪的致病性研究

本实验室2014年从福建省龙岩市某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株猪伪狂犬病毒变异株,命名为PRV Fujian-LY株。为了研究Fujian-LY株对免疫仔猪的致病性,将8头20龄的PRV抗原、gE抗体均为阴性,gB抗体均为阳性仔猪随机分为3组,其中2组(每组3头猪)分别通过肌肉注射和滴鼻接种Fujian-LY株,第3组2头仔猪做阴性对照。试验仔猪接种病毒24h后体温均开始升高,随着病程发展,呼吸系统症状明显,滴鼻接种组仔猪发病明显快于肌肉注射组,所有攻毒仔猪虽均有发病但未出现死亡。通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养、易感动物感染试验及gE抗体ELISA检测证实Fujian-LY株人工攻毒试验成功。gE抗体检测结果表明所有攻毒仔猪攻毒后7dPRV gE抗体开始阳转。对发病仔猪剖检可见,脑积液明显增多,脑膜血管充血,并伴有出血等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片观察结果显示发病仔猪脑实质中小血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞包围"血管套"现象,其他主要脏器也均有明显的病理变化。试验结果表明PRV Fujian-LY株为伪狂犬病毒强毒株。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及免疫原性初步研究

采集浙江某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑、脾脏等组织病料,经PCR检测为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒感染,用BHK-21细胞进行病毒的分离培养,结果显示该病毒能引起典型的细胞病变,第4代病毒液毒价达10^7.0 TCID_50/mL;PCR和动物回归试验结果表明该分离株为PRV,并将其命名为PRV ZJ株。将第4代病毒液制备成油乳剂灭活苗,免疫2 kg左右家兔,免疫后28 d采血并攻毒,测定其免疫原性,结果显示血清中和指数为13490,保护率为100%。本试验结果表明PRV ZJ株有很好的免疫原性,为进一步开展疫苗研究奠定基础。     

伪狂犬病C株与Bartha-K61株活疫苗在gE抗体阴性场的免疫效果比较

某伪狂犬病野毒阴性场,分别选用伪狂犬病疫苗C株和Bartha-K61株做仔猪免疫平行对比试验,采用IDEXX伪狂犬病ELISA试剂盒检测抗体滴度和阳性率,评估母源抗体干扰度和维持时间.检测结果表明,某厂家C株伪狂犬病疫苗效果优于某厂家Bartha-K61毒株.研究为规模猪场伪狂犬病疫苗毒株的选择提供参考依据.     

伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)生物学特性研究

测定了伪狂犬病gE^-／gI^-／TK^-／LacZ^ 基因缺失疫苗株(SA215)的致细胞病变效应、安全性、免疫原性和接种动物抗体消长规律等生物学特性。试验结果显示，该疫苗株能在Vero细胞上适应生长，并形成典型的蚀斑。其对1日龄仔猪、妊娠母猪、牛、羊以及家兔安全，无不良接种反应，接种动物不向外散毒。SA215疫苗接种猪能抵御高剂量(10’PFU)Fa株强毒感染，攻毒后试验猪的发热期、增重受阻天数、散毒滴度略低于Bartha株疫苗接种猪，低于对照组猪。SA215接种猪能维持长时间的高水平中和抗体滴度。试验结果表明，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。     

我国猪伪狂犬病变异株研究概况

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的、严重危害养猪业的一种烈性传染病。在过去的几十年里,我国通过在猪群中广泛使用Bartha-K61株基因缺失弱毒疫苗,使PR得到了有效控制。但自2011年以来,在全国范围内,许多Bartha-K61疫苗免疫猪群出现了PR疫情。研究证实,该疫情是由PRV变异株引起的,与以往毒株相比,PRV变异株致病性明显增强,且Bartha-K61疫苗不能对猪只提供完全的免疫保护。目前针对PRV变异株的疫苗正在研制中,其中基因缺失活疫苗能够对当前流行的PRV变异株提供完全的免疫保护,这些疫苗大多处于转基因安全评价阶段。在诊断方法上,已经建立了能够有效区分Bartha-K61疫苗株、PRV经典强毒株和当前流行的变异株的三重荧光定量PCR方法。利用安全有效的基因缺失疫苗和配套的鉴别诊断技术,并结合有效的生物安全防控措施,对PR进行净化,是未来必由之路。本文对我国当前PR的流行病学、诊断方法、疫苗研制和防控策略等进行了简述和讨论。     

猪脾转移因子提高Bartha-K61株伪狂犬病活疫苗免疫猪抗体水平的初探

为了解猪脾转移因子（TF）对伪狂犬病（PR）活疫苗（Bartha-K61株）免疫抗体的影响,本研究采用本课题组具有自主知识产权的中国发明专利制备3批猪脾TF,将PR活疫苗（Bartha-K61株）单独（单独免疫组）、分别与3批TF联合（联合免疫组1、联合免疫组2和联合免疫组3）免疫PR病毒（PRV）gB抗体阴性仔猪,并设立非免疫空白组,采用ELISA方法检测PRV抗体水平。结果显示,免疫后第7 d、14 d、28 d、42 d和56 d,联合免疫组1、联合免疫组2和联合免疫组3的PRV免疫抗体阳性率分别比单独免疫组高30%～40%、20%～40%、0%、20%和40%～50%。说明TF可以提高PR活疫苗（Bartha-K61株）的免疫抗体水平,为PR的防控提供参考。     

猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株和变异株主要免疫原性基因分析

自2011年底以来,我国多个省份暴发了猪伪狂犬病,一些研究院所证实当前猪伪狂犬病毒流行株发生了一定程度的变异,疫苗不能提供完全的保护。为了在分子生物学水平上比较不同厂家猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株,以及与当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株,在主要免疫原性蛋白之间的差异,选取了4个厂家的活疫苗Bartha-K61株,通过二代测序方法进行测序,对Bartha-K61株gB、gC和gD这3种主要免疫原性基因以及推导出的氨基酸序列与变异株之间进行同源性分析。结果显示,Bartha-K61疫苗株与变异株gB蛋白序列中有23处特征性的差异,同源性为96.3%~96.9%;gC蛋白序列中有25处特征性的差异,同源性为92.7%~93.1%;gD蛋白序列中有10处特征性的差异,同源性为96.8%~97.3%;以gB、gC和gD氨基酸序列建立的进化分析结果显示,Bartha-K61疫苗株与变异株分属两个不同进化分支。     

PRV变异株的分离及抗原差异性分析

2011年以来,我国多个省份免疫过伪狂犬病疫苗的规模化猪场发生新生仔猪出现神经症状和死亡的现象,并已确定为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株感染所引起。为探究现PRV流行株特性,2014年下半年以来,我们从免疫过伪狂犬疫苗却暴发伪狂犬病的猪场分离到3株伪狂犬病病毒(分别为XP,QJ,LY株),并对其gE、gB、gC全基因进行测序和序列分析,序列比对结果显示,3株PRV分离株与2012年后分离毒株有较高的同源性;进化树分析显示,3株PRV分离株的gE基因与2012年后分离毒株处在同一进化树分支上,而gB、gC则分别形成了独立的小分支,但仍处在同一较大分支上。我们对当地广泛使用的疫苗株HB-98和Bartha-K61活疫苗免疫血清与Ea,HNX株以及3株PRV分离株进行中和试验,结果显示,HB-98和Bartha-K61活疫苗免疫血清对早期分离株Ea株的中和能力高于HNX、XP、QJ、LY株,但在NX、XP、QJ、LY株之间无明显差异,表明3株PRV分离株的抗原性与2012年后分离毒株无明显差异,而与传统毒株Ea株的抗原性存在一定差异。