两组探针和SYBR Green染料qPCR检测柑橘黄龙病的灵敏度研究

本研究把柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）阳性核酸样品进行梯度稀释后,分别采用HLBp、CQULAP两组TaqMan水解探针法和以rpl基因为目的片段的SYBR Green染料法进行HLB实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)灵敏度检测研究,结果发现HLBp探针法可以从105倍稀释的阳性叶片核酸样品中检测到病原菌（病菌拷贝数约为60个）,高于CQULAP探针法和SYBR Green染料法;将三种qPCR检测体系用于赣州安远县、寻乌县和赣县送检的60份田间样品检测,结果HLBp探针阳性率为86.66%,CQULAP探针阳性率为60%,以rpl基因为目的片段的SYBR Green染料法检测阳性率为68.33%。     

支原体检验用培养基质控菌株的生长曲线与世代时间测定

为了摸索用于支原体培养基检验用质控菌株的生长规律,利用活菌计数方法测定滑液支原体、猪鼻支原体不同培养时段的颜色变化单位（CCU）,并绘制生长曲线,确定世代时间。结果表明：滑液支原体菌株迟缓期在培养后6h内,对数期为培养后6—36h,稳定期为培养后36～54h,衰老期为培养54h之后,世代时间G=231．8min;猪鼻支原体菌株迟缓期在培养后6h内,对数期为培养后6—18h,稳定期为培养后18～126h,衰老期为培养126h之后,世代时间G=117．1min。通过对质控菌株生长规律的初步探索,为培养基检验及质控菌株的使用提供了参考。     

牛病毒性腹泻病毒不同检测方法的比较研究

采用Idexx公司抗原捕获ELISA试剂盒对新疆部分地区160份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒抗原检测,结果有6份样品为阳性,对该6份血清用BVDV阴性血清进行了系列稀释后,分别用抗原捕获ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR进行检测,发现RT-PCR方法比ELISA检测灵敏度高10-100倍,荧光RT-PCR比RT-PCR灵敏度高约10-100倍。     

4种抗原定量方法观察牛支原体培养特征

为探索在疫苗研制过程中牛支原体抗原收获时间及抗原定量替代方法,将牛支原体08M株接种于含10%马血清的Thiaucourt's培养基,在110 h内同时监测其颜色变化单位（color change units,CCU）、菌落形成单位（colony forming units,CFU）、菌体蛋白浓度和核酸含量的变化,绘制相应曲线。活菌计数结果（CCU和CFU）显示,牛支原体生长可分为明显的4期,10 h进入对数期,30 h进入稳定期,活菌数最高可达1.0×10⁸ CCU/mL和7.7×10⁷ CFU/mL,75 h进入衰亡期;蛋白浓度从15 h开始迅速增长,至35 h蛋白浓度最高,为72.06 μg/mL,此后维持在58.38~70.65 μg/mL;核酸含量从15 h开始增长,至25 h后Ct值维持在15.32~17.84。结果表明,牛支原体蛋白含量在稳定期初期与活菌数具有良好的相关性。因此,在牛支原体灭活疫苗生产中,稳定期初期是最佳抗原收获时间,可用蛋白浓度法代替活菌计数法进行抗原定量。     

活细胞在线检测器在长双歧杆菌BBMN68培养中的应用研究

活菌数检测是益生菌培养过程分析的重要环节。传统以平板稀释法检测益生菌活菌数费时费力,且无法实现实时监测。本文探索了电容型活细胞在线检测器在双歧杆菌BBMN68培养过程中的应用效果,评价其检测活细胞量的可行性。研究表明,在菌体发酵生长的对数期,活细胞在线检测器的电容值与长双歧杆菌BBMN68活细胞量之间存在良好的线性关系,其线性相关系数为0.992,比吸光值法更准确地反映发酵体系中活细胞量的情况,在稳定期与衰亡期也表现出了良好的相关性。比平板计数法更快速,可以实现实时监控。电导型活细胞检测器为益生菌培养过程在线检测提供了一种简便、精确的方法。     

产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌分离株的生物学特性研究

对发酵黄芪样品中分离的1株产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌的生物学特性进行了检测,试验结果表明,菌株在10℃~60℃环境均能生长,最适生长温度为35℃~40℃。pH5.0~8.0培养基均适宜菌株生长,其中最适pH为6.0。在37℃环境200r/min振荡培养的生长曲线在0~4h为延迟期,4h~12h为对数期,12h~24h为稳定期,24h以后为衰亡期。细菌37℃培养32h开始产生芽胞,在培养72h时芽胞形成率达到80.67%。菌株对多数抗菌药物敏感,且安全性良好。该菌株适应性强,生长条件较为宽松,这为其开发应用提供了依据。     

3种定量检测绵羊肺炎支原体方法的比较

本研究采用改良Thiaucourt's培养基培养绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipleuneniae, MO)临床分离株SC01,收集不同时间的培养物,分别用颜色变化单位(CCU)法、浊度法及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法进行定量,并绘制MO生长动态曲线。CCU检测结果显示,接种后0～4 h为SC01的迟缓期,4～16 h为对数生长期,lg CCU/mL 最高达到10.7000±0.4700,16～20 h为稳定期,20 h以后进入衰亡期;浊度法定量检测结果显示,SC01培养物经过5倍浓缩后的D_{420 nm}随着培养时间延长逐渐上升,2 h时为0.0028±0.0002,4～12 h D_{420 nm}增加较缓慢,而12～24 h增加最快,24 h最高达到0.8609±0.0045,以后则趋于稳定;Real-time PCR法检测结果显示,SC01的拷贝数随着培养时间延长平稳上升,2 h时lg 拷贝/mL为4.5889±0.0048,在30 h时lg 拷贝/mL达到7.6165±0.1089。相关性分析结果表明,在迟缓期和对数生长期,CCU法与Real-time PCR法、CCU法与浊度法、Real-time PCR法与浊度法对MO的定量检测结果高度相关,相关系数分别为0.967、0.720和0.849,而Real-time PCR法和浊度法对MO的定量检测结果则在2～30 h内均高度相关,相关系数为0.912。经对检测所需时间及精确度等方面综合比较,本研究认为Real-time PCR法具有快速、准确及易标准化等特点,可以取代CCU法和浊度法用于MO的定量。     

保存液对唾液样品中非洲猪瘟病毒核酸保护效果的研究

本实验旨在评价保存液对唾液中非洲猪瘟病毒核酸的保护效果。通过以下分组进行实验:A组,5 ml唾液+50μl阳性样本(100倍稀释);B组,5 ml唾液+5μl阳性样本(1000倍稀释);C组,棉签沾取100倍稀释样品放入保存液;D组,棉签沾取100倍稀释样品放入生理盐水;E组,原唾液(空白)样本。在1 h、7 h、22 h和35 h这个四个时间点,分别通过柱式和磁珠法提取非洲猪瘟病毒的核酸,并通过荧光定量PCR检测样品中的病毒核酸含量,结果表明,无论是柱式法还是磁珠法提取,A、B和D组的Ct值随着时间推移均在变大,而C组(保存液)Ct值趋于稳定,说明保存液对非洲猪瘟病毒降解具有一定的减缓效果。     

竞争性酶联免疫法检测鸡克雷伯氏菌病的研究

本试验建立了竞争性酶联免疫法检测鸡克雷伯氏菌病。对６４份鸡血清检测，阳性率４２．２％（２７／６４），灵敏度，阳性血清可稀释到１：２０００。本法与大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、亲水气单胞菌、温和气单胞菌、葡萄球菌无交叉反应比凝集法［阳性单：１８．８％（１２／６４）灵敏度，１：２５６］优越。由此可见用竞争性防酶免疫法检测鸡克雷伯氏菌病，是一种快速、敏感、特异、准确的方法，可广泛应用于大田检测。     

五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

目的：研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取仪磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取仪磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取仪磁珠RNA提取法等五种不同核酸提取方法对不同含量猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性样品的相对提取效率,为动物疫病监测诊断实验室核酸提取方式的选择提供技术参考。方法用五种不同核酸提取方法对4份10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清、2份PRRSV阳性组织悬液及其离心后的上清液共8份样品同时进行核酸提取,用荧光RT-PCR方法进行检测,获取各样品PRRSV荧光RT-PCR结果的CP值,分析五种提取方式的相对提取效率。结果对合适的提取样品,磁珠提取法相对提取效率最高,吸附柱法其次,Trizol提取法相对效率较差;在三种磁珠提取法中,提取效率相差在2个CP值内,差异不明显,但以天隆磁珠提取法提取效率更高。结论预装试剂结合仪器自动化操作的磁珠法提取效果稳定,效率最高;国产仪器国产试剂提取效率不亚于进口仪器和试剂。     

聚合酶螺旋反应快速检测沙门氏杆菌方法的建立

为了建立一种快速、灵敏且特异的沙门氏杆菌快速筛选检测方法——聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR),试验针对沙门氏杆菌菌毛保守操纵子bcfD基因设计特异性扩增引物,通过优化反应温度、dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度和反应时间以确定最佳反应体系;随后选取4株沙门氏杆菌标准菌株和12株近源菌进行特异性试验;通过菌落计数法和倍比稀释法确定PSR方法的最低检测灵敏度,并与常规PCR方法进行敏感度比较;用稀释后的沙门氏杆菌纯菌液人工随机污染40份不含沙门氏杆菌的生猪肉样品,模拟并评价PSR方法在现场检测中的应用效果。结果表明:试验成功建立并优化了PSR方法,最佳反应温度为65℃、dNTPs浓度为0.3 mol/L、Mg~(2+)浓度为3.0 mmol/L、最佳反应时间为45 min;PSR方法可以特异性扩增4株沙门氏杆菌,而对其他12株近源菌的扩增结果呈阴性;经菌落计数和倍比稀释后,PSR方法的最低检出量为4×10~(1 )cfu/mL,为常规PCR方法的100倍;从40份经人工随机污染生猪肉样品中共检测出阳性样品7份,与传统培养法的检测结果一致,检出率均为17.5%。说明试验建立的PSR方法对沙门氏杆菌的检测特异性强、灵敏度高,且不需要昂贵的设备即可在短时间内实现对沙门氏杆菌属的快速检测。     

日本鳗鲡脾脏抗菌肽抗菌活性检测方法的比较

本试验旨在建立一种在日本鳗鲡脾脏抗菌肽分离纯化过程中简便、灵敏的检测其抗菌活性的方法。试验以日本鳗鲡脾脏分子质量小于10 ku的蛋白质为抗菌肽样品,选择琼脂板孔穴扩散法和微孔液体培养法2种传统方法及微量液体培养法为检测方法,比较这3种方法在抗菌肽对3种鳗鲡常见致病菌株(迟钝爱德华菌、气单胞菌、嗜水气单胞菌)抗菌活性检测中的灵敏度和优缺点。结果表明:与琼脂板孔穴扩散法及微孔液体培养法相比,微量液体培养法简便、易于观察结果,具有最高的灵敏度且样品用量最少,适合在鳗鲡脾脏抗菌肽分离纯化过程中跟踪检测抗菌活性,尤其适合分离纯化后期获得微量单一样品抗菌活性的检测。由此得出,微量液体培养法适用于检测日本鳗鲡脾脏抗菌肽的抗菌活性。     

猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值竞争ELISA检测方法的建立

为了建立猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值竞争ELISA检测方法,试验以猪肺炎支原体全菌体为包被抗原,以抗猪肺炎支原体高免血清为检测抗体,建立猪肺炎支原体竞争ELISA抗原检测方法,并验证方法的灵敏度、特异性,再根据量反应平行线测定法原理建立猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值检测方法,并考察方法的批内和批间重复性。结果表明:建立了猪肺炎支原体竞争ELISA反应体系,包被抗原浓度为32μg/mL,阳性血清稀释度为1∶25 000,阴性血清稀释度为1∶320;封闭液为5%脱脂奶粉,封闭时间为1.5 h;酶标二抗稀释度为1∶20 000,作用时间为1.5 h; TMB显色时间为室温15 min;试验成立条件为阳性血清OD₄₅₀值0.7～2.0,阴性血清OD₄₅₀值<0.3;该方法线性相关系数为0.995 5,线性范围为10～1 280μg/mL,与猪细小病毒、猪流感病毒、猪鼻支原体等8种异源蛋白无交叉反应。在猪肺炎支原体竞争ELISA抗原检测体系的基础上成功建立了灭活疫苗相对效力值检测方法,该法的批内变异系数<5%,批间变异系数<10%;...     

内蒙古地区乳样中牛支原体的分离及PCR鉴定

为检测内蒙古地区某牛场患乳房炎的奶牛乳样中是否存在牛支原体,同时建立直接提取乳样中牛支原体DNA进行PCR检测的方法,本研究无菌采集乳房炎乳样,通过支原体的分离培养、形态学观察和生化试验,初步鉴定分离株为牛支原体,然后提取液体培养基菌体DNA进行牛支原体特异性PCR鉴定,同时,采用Chelex-100法直接提取原乳样中菌体DNA进行PCR鉴定,并测序分析扩增片段序列。液体培养物提取DNA与Chlex-100法直接提取原乳样菌体DNA进行特异性PCR均扩增出目的条带,该片段序列与GenBank中牛支原体oppD/oppF基因的同源性达到99.8%,证实分离株为牛支原体。说明Chlex-100法可直接提取乳样中牛支原体DNA进行快速PCR鉴定。     

基于Taq Man探针的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL;用该方法对6份不同的组织样品进行重复性检测.结果显示具有良好的重复性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法与常规RT-PCR阳性符合率为100%.但检测灵敏度高出常规RT-PCR 100倍.     

倾注法与涂布法对蜂蜜中嗜渗酵母计数的比较分析

本研究旨在建立准确、可靠、稳定的检测蜂蜜中嗜渗酵母计数的分析方法。分别采用GB 14963-2011中嗜渗酵母计数的涂布方法以及GB 4789.2-2010中菌落总数测定的倾注法,对蜂蜜样品中的嗜渗酵母计数。并通过以上两种不同方式对不同温度下储藏的蜂蜜样品进行比较试验。结果发现同一样品、同一稀释度、同样的培养条件下,使用倾注法测得的嗜渗酵母数量比涂布法更多,差异极显著(P0.01)。对经不同温度下储藏的蜂蜜样品进行嗜渗酵母计数,各浓度条件下倾注法计数结果比涂布法更多,差异极显著(P0.01)。     

HI试验β──微量法操作技术的改进

ＨＩ试验β──微量法操作技术的改进陈其新，吴真军（江苏沭阳县畜牧兽医站２２３６００）现行教科书和实验手册中，鸡新城疫ＨＩ抗体的测定所采用的β－微量法，在血清倍比稀释时，通常采用５μｌ定量移液器或１８＃针头（磨平）吹打稀释。笔者认为，ＨＩ试验的关键步骤...     

水浴法测定饲料中钙含量的研究

1、材料与方法。1.1、材料。1.1.1、 实验样品与试剂（本实验是高锰酸钾滴定法（国标法）改进方法,只说明与国标法不同之处）。实验样品取材于浓缩饲料和配合饲料中的12个样品,将其分为高、中、低不同的浓度段,每个浓度段包括4个样品;实验试剂：氨水溶液：1：4;1：100（V：V）;40g/L草酸铵溶液：溶解40g分析纯草酸铵（HG3-976）于水中,稀释1000L的容量瓶;高锰酸钾标准溶液：c（1/5KMnO）=0.0513mol/L;醋酸.1：4（V：V）.     

基于SYBR Green Ⅰ的桑树皱叶病毒qPCR检测方法的建立及应用

根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10~4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10~2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。     

猪支原体肺炎LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用

旨在采用环介导等温扩增（LAMP）和横向流动试纸条（LFD）相结合的方法，建立一种快速、特异，过程可视化的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）检测方法。针对猪肺炎支原体（Mhp）P36基因设计5套特异性引物和1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针，进行LAMP扩增反应。将生物素标记的LAMP产物与FITC标记的探针进行特异性杂交，并使用横向流动试纸条完成扩增产物的检测。经优化，LAMP最佳反应条件为65℃，反应15 min，从基因组DNA提取到LFD结果判断只需40 min左右，比常规PCR技术缩短近2 h。LAMP-LFD可特异性地检出猪肺炎支原体（Mhp），对猪鼻支原体（Mhr）及猪圆环病毒（PCV）等常见猪病病原的检测结果为阴性。灵敏性试验表明，LAMP-LFD对Mhp的检测灵敏度为1×10⁰个拷贝DNA，是普通PCR的1 000倍。利用本方法可从采集的88份临床疑似病料样品中检测到64份阳性，国标PCR方法可检测到56份阳性，符合率可达90.9%。综上，本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、准确地应用于Mhp的检测，而且灵敏度高、操作简单、仪器设备依赖性低、检测成本低、耗时短，适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用，具有较高的推广价值，有望发展成为Mhp快速检测的有效手段。