利用转基因番茄表达人成纤维细胞生长因子21(FGF21)

【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast growth factor-21,FGF21),为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi)作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ(简写为p1390RⅡ)上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)"中蔬6号",采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。     

利用转基因番茄表达人成纤维细胞生长因子21(FGF21)

【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21（Fibroblast growth factor-21,FGF21）,为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因（pmi）作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ（简写为p1390RⅡ）上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)“中蔬6号”,采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。     

农杆菌介导的成纤维细胞生长因子-21基因转化甘蓝型油菜研究

【目的】利用基因工程技术获得FGF21转基因油菜植株,为FGF21蛋白生产体系的建立奠定基础。【方法】将人源FGF21基因的cDNA序列,根据植物偏好密码子进行改造,并通过PCR拼接技术扩增FGF21全长基因,将该基因插入油菜油体特异表达载体,通过冻融法转到根瘤农杆菌LBA4404,叶盘法转化甘蓝型油菜"沪油15",并对转基因油菜进行PCR检测和Southern blot分析,最后对FGF21蛋白在转基因油菜种子中的表达的进行了Western blot分析。【结果】合成了FGF21全长基因,成功构建了含FGF21基因的植物双元表达载体p1390yoFGF21,并建立了油菜遗传转化体系。通过油菜遗传转化获得2株转基因植株,PCR扩增和Southern blot检测证实,重组FGF21基因已整合到油菜基因组中;Western blot分析检测显示,FGF21在转基因油菜种子蛋白中具有一定水平的表达量,并具有良好的抗原性。【结论】FGF21基因被成功整合到油菜基因组中,收获的T0代种子蛋白具有良好的抗原性。     

人成纤维细胞生长因子FGF10的红花油体表达系统构建

利用红花油体系统表达人成纤维细胞生长因子10(FGF10)。将人源FGF10基因克隆至植物油体表达载体p CAMBIA1390Do(p1390Do)上,构建重组融合表达质粒p1390Do FGF10。通过农杆菌介导的叶盘法将FGF10转入红花,采用潮霉素(Hyg)筛选获得红花阳性苗。转基因红花经PCR、Southern和Western检测。PCR检测和Southern分析结果表明,Oleosin-FGF10基因已经成功转入红花中。Band Scand 5.0软件分析Western电泳图图谱结果显示,FGF10融合蛋白含量约占转基因红花种子可溶性蛋白的3.25%,并具有良好的反应原性。     

鸡β-防御素Gal-3在转基因紫花苜蓿中的表达

【目的】在紫花苜蓿中表达鸡β-防御素3(Gal-3),为利用紫花苜蓿规模化生产Gal-3奠定基础。【方法】PCR扩增鸡Gal-3基因,以潮霉素作为转基因植物的选择标记,将鸡β-防御素Gal-3基因克隆至表达载体pCAM-BIA1390R(简写为p1390R)上,构建重组表达质粒p1390R-Gal-3;采用冻融法将质粒p1390R-Gal-3转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化至紫花苜蓿;采用PCR检测、Southern blot筛选阳性转基因苜蓿植株,并对Gal-3蛋白进行抑菌活性研究。【结果】PCR扩增获得了240bp的鸡Gal-3基因,成功构建植物表达载体p1390R-Gal-3,在苜蓿中初步建立了Gal-3的遗传转化体系,共获得22株转基因苜蓿植株,其中4株为阳性植株,转化率为18.2%。PCR扩增和Southern blot检测表明,Gal-3基因已整合到转基因苜蓿基因组中。提取转基因苜蓿的Gal-3蛋白进行抑菌活性试验,结果显示转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有抑制作用。【结论】获得了具有抑菌活性的转鸡β-防御素Gal-3基因的苜蓿植株。     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。     

oleosin-MT融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在拟南芥种子中成功表达,其分子质量为26ku;总蛋白质量浓度达到50μg/μL时,超氧阴离子的清除率最高,为58.5%;总蛋白质量浓度为10μg/μL时,羟自由基清除率可达69.7%。【结论】成功获得转MT基因的拟南芥株系,并证明融合蛋白oleosin-MT在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。     

转角质细胞生长因子-2基因红花研究

【目的】构建转角质细胞生长因子-2基因(KGF2)红花,为KGF2药用蛋白的生产奠定了基础。【方法】利用融合PCR方法扩增人源KGF2基因与拟南芥油体蛋白Oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建了重组质粒pOP-OL-KGF2,采用冻融法将质粒pOP-OL-KGF2转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,采用PCR检测筛选转基因红花阳性植株,SDS-PAGE检测Oleosin-KGF2融合蛋白的表达情况。【结果】成功构建了植物特异表达载体pOP-OL-KGF2,转染后共获得了12株转基因红花植株,其中2株鉴定为阳性,阳性率为17%,对转化植株进行DNA水平检测和蛋白水平检测,可知KGF2基因已经整合进红花基因组中,且有所表达。【结论】成功获得转KGF2基因的红花株系。     

拟南芥热激转录因子AtHsfA6a的克隆与细胞定位分析

【目的】研究拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在植物细胞中的定位及其作用机制。【方法】用RT-PCR方法从野生型拟南芥总RNA中,扩增获得了849 bp的拟南芥热激转录因子AtHsfA6acDNA片段,经过测序,结果与公布的序列完全相同。将该片段与绿色荧光蛋白(GFP)基因的cDNA重组,并克隆到表达载体pCHF3上,经PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确。按照Clough等的方法转化拟南芥,经Kanamycin筛选和PCR检测,得到转基因植株;用激光共聚焦扫描荧光显微镜观察转基因植株幼苗的根部。【结果】在正常条件下,融合蛋白存在于细胞质中。【结论】在正常条件下拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在细胞质中表达。     

大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

两株白粉寄生孢的生物学特性比较

对L9和L3两个白粉寄生孢菌株的生物学特性研究表明,它们的生长适温为10～30℃,其中最适生长温度分别为25℃和20℃;适宜生长的pH为4～10,其中最适pH均为8.有利于L9菌株菌落生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉、乳糖和牛肉膏;有利于L3菌株菌落生长的碳、氮源分别为葡萄糖、乳糖和蛋白胨;改良查氏培养基有利于两者菌落的生长.     

不同杀菌剂对3种马铃薯病害病原菌的毒力测定

采用生长速率法测定3种生物农药和3种化学药剂对马铃薯晚疫病菌、早疫病菌和黑痣病菌的室内毒力。结果表明：100万孢子/g寡雄腐霉WP对晚疫病菌、早疫病菌和黑痣病菌毒力较好,其EC₅₀分别为  0.041 2  μg/mL、0.000 1  μg/mL和0.052 0  μg/mL;0.3%四霉素AS对3种马铃薯病害病原菌的EC₅₀分别为0.009 3  μg/mL、0.208 4  μg/mL和0.265 9  μg/mL;3%中生菌素WG对3种病原菌的毒力较弱,EC₅₀分别为 7.494 1  μg/mL、2.035 6  μg/mL和20.266 6  μg/mL;20%烯肟·戊唑醇SC对3种病原菌的EC₅₀分别为  0.435 9  μg/mL、0.003 9  μg/mL和1.114 0  μg/mL;50%锰锌·氟吗啉WP对3种病原菌的EC₅₀分别为  1.216 2  μg/mL、0.192 5  μg/mL和5.153 5  μg/mL;30%苯甲·嘧菌酯SC对3种病原菌的EC₅₀分别为  11.270 1  μg/mL、0.227 8  μg/mL和6.071 8  μg/mL。综上所述,100万孢子/g寡雄腐霉WP、0.3%四霉素AS和20%烯肟·戊唑醇SC对马铃薯晚疫病、早疫病和黑痣病室内毒力较好。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具...     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

两种药用植物残渣堆肥浸提液对黄瓜3种病害防治效果

通过室内孢子萌发试验和盆栽试验测定了药用植物砂地柏和马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病、霜霉病和炭疽病的活性.孢子萌发试验结果表明,马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病菌和炭疽病菌孢子萌发具有显著的抑制作用,抑制率分别达到78.69%和60.28%,对黄瓜霜霉病菌孢子萌发的抑制效果较差;砂地柏残渣堆肥浸提液对黄瓜炭疽病菌孢子萌发具有显著抑制作用,抑制率达到59.75%,对其他两种病原菌孢子萌发的抑制效果较差.盆栽试验结果表明,两种药用植物残渣堆肥浸提液对黄瓜3种病害的防治效果随浸提液含量的增加而增大,当使用浸提液原液时,砂地柏残渣堆肥浸提液和马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病的防治效果最好,保护和治疗效果分别为66.30%、61.02%和78.72%、76.75%,其次为黄瓜霜霉病,对黄瓜炭疽病的防治效果较差.     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2基因的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。