亚洲璃眼蜱唾液腺一新基因(GP29)的原核表达及产物鉴定

将吸血诱导的亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因GP29的开放性阅读框插入pGEX-4T-1,转化BL21,表达出一相对质量为53 ku的蛋白,其大小与预计结果一致。蛋白质的肽质量图谱和“1381.7511”肽段序列两方面的结果证明,SDS-PAGE胶板上相对质量为53 ku的蛋白就是由目的基因表达的GST融合蛋白。该蛋白与SwissPROT库中的任何蛋白均有较大差别,可能是一个新功能分子。     

亚洲璃眼蜱唾液腺新基因GP15的表达和鉴定

将GP15的阅读框序列插入pET32a( )制成重组质粒,通过BL21成功表达出相对分子质量为36 000的蛋白.该蛋白可被His·Bind从细菌裂解物纯化出来,也可为抗融合蛋白抗体所识别.表达形式分析显示,融合蛋白以包涵体形式在大肠肝菌内表达.     

亚洲璃眼蜱差异表达新基因P18的克隆和鉴定

为了进行抗蜱和蜱传病疫苗的研究,本实验对亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中获取的一个全长编码基因P18进行了研究。该基因全长519bp,共编码170个氨基酸,分子量为18.36Ku,等电点为4.28。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与肩突硬蜱、篦子硬蜱唾液腺的抗凝血小肽有30%～40%低度同源性。将该基因亚克隆到pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,重组融合蛋白以可溶性形式高效表达。将可溶性重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清。经免疫印迹分析表明,该重组蛋白抗体可特异性的识别半饱雌蜱唾液腺中的天然蛋白抗原,而未吸血雌蜱唾液腺中则不显现特异条带。RT-PCR结果进一步证实,该基因在蜱吸血后的唾液腺中差异表达。     

小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定

本研究旨在建立小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨它们的系统发生关系。在新疆、内蒙古从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增测序获得3种璃眼蜱的16S rRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome oxidaseⅠ,COⅠ)序列后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱样本16S rRNA序列与GenBank中已知相应蜱虫16S rRNA序列聚类,而残缘璃眼蜱COⅠ序列与GenBank中已知残缘璃眼蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析

从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只，随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺．半饱血组于蜱吸血第5d采集，分离唾液腺。Trizol法提取总RNA，经第一链合成、LD—PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交（SSH）等步骤，获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT—Easv我体连接，转化DH5a，获得204个白色菌落。扩增检查表明，136个克隆含有插入片段，片段大小为250bp-850bm，测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT—PCR检查结果初步断定，本研究消减效果良好。由网上资源分析得：21个片段与其他蜱的基因，19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因，9个与果蝇的基因具有同源性。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白P36的分子鉴定及重组表达

为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,本研究从亚洲璃眼蜱唾液腺中克隆获得一个编码免疫抑制蛋白P36的同源性基因,该基因全长924bp,编码区为708bp,预测的编码蛋白包含235个氨基酸,分子量为27ku。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与美洲花蜱和安氏革蜱唾液腺中的免疫抑制蛋白P36高度同源。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,但吸血后表达。将目的基因与载体pGEX-4T-1连接后转化BL21表达菌,经诱导后得到GST融合重组蛋白。该实验结果为进一步研究P36奠定了基础。     

亚洲璃眼蜱唾液腺一新功能基因的克隆与测序

HaB1是亚洲璃眼蜱雌成蜱唾液腺差异表达基因文库中的一个片段,根据其序列设计引物HaB1-GSP1和HaB1-GSP2,以唾液腺总RNA为模板,RACE法扩增获得HaB1的未知3′-末端。测定该末端序列,进行序列拼接,设计全长引物5-′CCAGTCCGAAGGAAGGGCG-3′和5-′TCTC-CGGGCACGTGAAGTGTC-3′。以cDNA第一链为模板,扩增获得基因全长。经核查表明,该基因为一新基因(登录号AY803896)。     

亚洲璃眼蜱P27基因的克隆和表达模式分析

为了进一步研究蜱吸血时唾液腺的基因表达调控机制,并为蜱疫苗的制备筛选功能性抗原,本试验对从亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中筛选出的一个具有Poly（A）尾的EST序列P27进行了研究。首先运用RACE技术扩增出该基因的5′端,在此基础上设计引物,扩增出该基因全长,此基因全长827bp,其开放阅读框从第35个碱基始至第706个碱基止,预测分子量为27．28ku,等电点4．22。生物信息学结构分析表明该基因含有跨膜区及多个活性位点,可能与细胞内DNA的转录相关;该基因与现有其他基因同源性很小,为一新基因;RT-PCR结果显示该基因在半饱血雌蜱的唾液腺、蜱壳、中肠均有表达,但在壳中表达丰度稍低。本研究克隆的P27基因序列已登录GenBank,序列号为EU180067。     

小亚璃眼蜱和亚洲璃眼蜱对环形泰勒虫传播能力的研究

将实验室培养的小亚璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum)和亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum asiaticum)清洁幼虫和若虫饲喂于感染环形泰勒虫的牛体，收集饱血幼虫和若虫，用所孵化的若虫和成虫感染试验牛。结果显示，小亚璃眼蜱幼虫、若虫阶级感染，所发育之若虫、成虫均可传播环形泰勒虫；而亚洲璃眼蜱各阶级的传播试验结果均为阴性。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白p36基因的RNA干扰研究

本研究利用RNA干扰技术研究亚洲璃眼蜱p36基因在其生长、发育、繁殖方面的生物学功能。通过注射p36基因的dsRNA成功实现了该基因的表达沉默,干扰组表达量下降了99%。蜱p36基因沉默后,24 h的吸附率下降了50%,饱血率下降了55.5%,卵孵化率下降了100%。结果表明p36基因在亚洲璃眼蜱吸血和繁殖中具有重要作用。     

亚洲璃眼蜱唾液腺多肽Ha-11的鉴定、表达和生物学功能的初步研究

本研究对亚洲璃眼蜱多肽Ha-11的编码基因进行了克隆、表达和初步的功能分析。该基因开放阅读框（open reading frame,ORF）为372 bp,编码123个氨基酸,其中含23个氨基酸的信号肽。将去除信号肽的编码区基因亚克隆至pGEX-4T-1载体,大肠杆菌中诱导表达,获得了37 kDa重组蛋白。抗重组Ha-11蛋白的免疫血清识别半饱血雌蜱的唾液腺中约11 kDa的天然蛋白。Real-time PCR结果表明该基因在亚洲璃眼蜱的各发育阶段、各组织中均有表达,但以若蜱表达量最高,而组织中以淋巴液表达量最高。重组蛋白在体外可以抑制脾细胞增殖和细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌。研究结果显示Ha-11在蜱吸血过程中可能具有抗炎作用。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生.蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物.蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等[1],对动物和人类的健康造成严重危害.肌动蛋白(Actin)是一类进化保守,在多数物种中存在的蛋白质超家族,其基因序列高度同源[2].Actin是细胞组成的基本单位,参与多种生理过程,如细胞运动、胞内运输、细胞质流动、内吞作用等[3].Actin基因及蛋白同时也是多数实验中的首选内参,对完善实验数据、数据分析和实验过程的逻辑性起到重要作用.目前少见对镰形扇头蜱成蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的报道.据此,我们克隆了三种硬蜱的Actin基因,进行了序列分析.     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Aclin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生。蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物。蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等,对动物和人类的健康造成严重危害。     

麻点璃眼蜱的鉴定及部分生物学特性研究

1999－2000年3－9月份从甘肃省永靖县的绵羊、山羊体表采集蜱842只（雄虫453只，雌虫389只），经鉴定为麻点璃眼蜱(Hyalomma rufipes).该种蜱对山羊的侵害大于绵羊，，一般寄生于羊后肢内侧，肛门周围和母亲外生殖器周围等无毛或毛稀少、毛毛短的部位。经实验室人工饲养，证明该种蜱为二宿主蜱，饱和血雌虫产卵前的生殖滞育期平均39．5d，产卵期平均22．5d，卵孵化平均27d，幼虫从开始吸血到变为饱血若虫19．5d，饱和血若虫蜕皮约37d；成虫活动季节为3－10月份，5－6月份为高峰期，羊在高峰期的感染率达100％。     

中哈边境阿拉山口口岸输入性亚洲璃眼蜱的种类鉴定与分析

对1批从哈萨克斯坦进口羊毛中检获的蜱样品进行种类鉴定。应用16S rDNA基因和COI基因两条DNA条形码技术进行鉴定分析。结果 16S rDNA序列分析显示与新疆亚洲璃眼蜱(KC203351)同源性最接近(99%);COI基因序列分析显示与新疆伊犁亚洲璃眼蜱(KF527440)同源性最接近(99%)。结论:经DNA条形码比对,确定为亚洲璃眼蜱,应加强对外来医学媒介生物防控,严防外来病入侵。     

新疆边境昆玉市亚洲璃眼蜱形态及分子生物学鉴定

试验旨在了解新疆边境地区昆玉市的蜱种分布状况.从该地区骆驼体表采集寄生蜱虫,应用数码体视显微镜初步进行形态学鉴定,采用蜱种鉴定的特异性引物对总DNA进行分子生物学检测,采用MEGA 10.0软件邻接法构建遗传进化树,确定蜱虫的进化生物学特征.结果表明,从昆玉市骆驼体表采集的蜱样符合亚洲璃眼蜱的形态学特征,线粒体16S ...     

盾糙璃眼蜱传播的牛泰勒虫分离鉴定及生物学特性

自新疆伊宁地区黄牛体表采集的盾糙璃眼蜱饥饿或半饱血成虫,带回实验室感染除脾牛.经血涂片检查发现,于感染后第21天,病牛血液中出现一种以圆环形与卵圆形为主的泰勒虫.经形态学观察和18 S rRNA基因测序和进化关系分析证明,它们为环形泰勒虫.将此饱血成蜱经实验室饲喂条件下,孵化出的幼虫分别饲喂于牛与家兔两种不同的动物,结果在饱血若虫阶段所有的蜱均从两种动物体表脱落,不再叮咬,饥饿成蜱又更换另一宿主,证明其是二宿主蜱.     

鸡大肠杆菌iss基因的克隆测序及原核表达

本实验对鸡大肠杆菌O2血清型菌株进行iss基因克隆测序，并在此基础上设计出两对套式引物，分别对含信号肽Miss基因序列和不含信号肽Miss基因序列进行扩增，并与原核表达载体pGEX-6p-1连接进行原核表达。iss基因克隆测序的结果与两组国外发表Miss基因序列进行比对，其同源性达100％。SDS—PAGE鉴定显示融合蛋白获得了较理想的表达，融合蛋白分子量分别约为36kD和33kD。     

牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。