江浙部分地区牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查及BVDV-2型毒株分离鉴定

为了解江浙地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的流行情况,于2016～2017年在江浙部分地区采集了145份临床腹泻犊奶牛血清样品,并对其进行RT-PCR检测,对阳性样品的5′-UTR和N~(pro)基因进行序列与遗传进化树分析。145份血清样品中共有19份样品为BVDV阳性,阳性率为13.1%,其中江苏和浙江地区的阳性率分别为14.1%和11.9%。根据阳性样品的5′-UTR和N~(pro)基因序列进行遗传进化树分析,18份样品为BVDV-1型,包括1a(n=2)、1b(n=6)、1c(n=2)、1m (n=7)和1q(n=1)亚型;1份样品为BVDV-2型,其5′-UTR和N~(pro)基因序列分析均显示与我国吉林分离株BVDV-2SD1301同源性最高,分别为99.0%与97.0%。同时,对BVDV-2型阳性样品进行病毒分离、RTPCR检测和IFA鉴定,证实成功分离到1株非致细胞病变型(ncp)BVDV-2病毒,命名为BVDV-2JZ21。结果表明:江浙部分地区存在较高比例的BVDV感染,且基因型多样,其中BVDV-1b与1m亚型为该地区感染的主要亚型,分别占33.3%和38.9%。此外,该地区已存在BVDV-2感染。这一研究丰富了BVDV的分子流行病学数据,也为BVDV疫苗研制提供了一定的理论基础。     

西部散养肉牛病毒性腹泻病毒流行及遗传变异

【目的】牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）是一种可导致养牛业出现重大经济损失的常见病原体。该文以中国西部散养肉牛为研究对象,拟通过血清学方法和生物信息分析,评估BVDV在中国散养肉牛中的整体流行状况,探究国内流行的BVDV基因多样性,为制定针对BVDV的合理防控措施和疫苗的研发提供理论依据与素材。【方法】2014-2015年分别从云南、新疆、甘肃和内蒙古4省（区）采集散养肉牛的血清样本共1 332份,利用BVDV抗体检测试剂盒进行检测,统计不同地区散养肉牛BVDV抗体阳性率。将抗体阴性的血清样本进行BVDV抗原检测,抗原阳性或可疑血清接种MDBK细胞,连续盲传五代分离病毒。根据BVDV 5'-UTR保守序列设计引物,经RT-PCR扩增5'-UTR序列并测序。利用Sequencher4.2、BLAST、ClustalX、MEGA5.2等软件对序列进行生物信息学分析,绘制流行毒株系统进化树,确定分离毒株的基因型。【结果】4省（区）散养肉牛BVDV整体抗体阳性率为33.93%。血清抗体阳性率从高到低依次为内蒙71.43%,新疆57.69%,甘肃第16.54%,云南10.0%。BVDV抗原整体阳性率为1.58%,新疆抗原阳性率最高。研究共分离13株BVDV流行毒株,分别命名为甘肃120、内蒙1369、伊犁霍清12953、伊犁霍清12960、伊犁霍清12981、博州精河13001、博州精河13023、博州精河13033、新疆奇台13041、新疆奇台13042、新疆奇台13191、新疆奇台13220、新疆奇台13251。进化树分析显示新疆地区散养肉牛中流行的主要是BVDV-1q和BVDV-1f,内蒙地区流行的主要是BVDV-1m,甘肃地区流行的是一种新的基因亚型BVDV-1u。【结论】通过血清学方法检测发现,虽然4个省（市、自治区）散养肉牛整体抗体阳性率低于国内平均水平,但情况却不尽相同。内蒙古和新疆抗体高阳性率表明BVDV在这些地区散养肉牛中已经广泛流行,必须采取适当措施将其危害性降到最低。从基于5'-UTR序列绘制的系统进化树可以看出,不同地区散养肉牛感染的BVDV基因亚型有所不同。总体看来,BVDV在散养肉牛中的分布呈现多样性,跨物种、跨地域传播和高突变性等特点,这些都使疫苗免疫策略面临严峻的挑战。研究通过对各地区散养肉牛的随机大量采样、检测和分析,客观评价BVDV在散养肉牛中的流行情况,为更好的制定预防策略提供参考依据。     

上海郊区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型分析

采用RT-PCR方法对2014年在上海郊区某奶牛场分离得到的牛病毒性腹泻病毒(BVDV SHYB)进行基因组5'UTR、Npro和E2基因扩增,并对PCR产物进行克隆、测序和BLAST比对分析,构建系统进化树和进行SimPlot重组分析。结果表明:2014年上海郊区奶牛场感染的BVDV 5'UTR保守序列与猪源性BVDV-1m亚型的ZM-95病毒株高度同源,属BVDV-1m基因亚型,命名为BVDV-1 SHYB;紧接着BVDV-1 SHYB病毒株5'UTR序列后面的Npro基因与BVDV-1b亚型病毒株同源性高,在5'UTR基因的3'端与Npro基因连接处有基因重组位点。     

三株分离于新生小牛的牛病毒性腹泻病毒株的基因组特征

为研究我国不同地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染新生小牛的遗传演化规律。以实验室保存的来自山东、内蒙古和宁夏的新生荷斯坦小牛血清为材料，利用RT-PCR方法对小牛血清进行BVDV RNA检测，并将检测为阳性的血清接种于牛肾细胞(MDBK),经分离鉴定获得3株BVDV野生株，分别命名为21NM-44、21NX-53和21SD-16。根据3株病毒对MDBK细胞的致细胞病变能力，判定21NM-44为非致细胞病变型毒株，21NX-53和21SD-16为致细胞病变型毒株。利用特异性PCR引物，克隆鉴定得到3株病毒的全基因组序列，依据全基因组序列建立系统进化树并分析其遗传演化关系。结果表明，3株来自不同地区的BVDV野生分离株与BVDV GXNN1毒株(BVDV-1c)具有高度的遗传演化关系，而BVDV-1c作为优势流行株存在于我国新生荷斯坦小牛。本研究结果可以为进一步研究BVDV在我国的演化规律奠定基础。     

新疆部分地区牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定及分子流行病学调查

【目的】了解新疆地区牛病毒性腹泻(BVD)的流行状况,【方法】采用RT-PCR方法对从新疆16个不同地区采集的样品进行BVD病毒5'-UTR扩增,对扩增出的序列进行测序,构建系统遗传进化树和遗传变异分析。【结果】566份样品中,扩增出21份阳性样品,平均阳性率为3.71℅。通过对分离株序列的同源性比对分析,17株为BVDVI型,4株为BVDVⅡ型。经对PCR扩增阳性样品进行细胞传代,有7株为致细胞病变型(CP),14株为非致细胞病变型(NCP)毒株,所测得的病毒滴度为1.04×103~6.02×108TCID50/0.1 m L,21株分离病毒对BVDV阳性血清的中和效价为1:21~1:25。【结论】BVD在新疆地区均不同程度的发生和流行。研究的成果,为BVD的有效防控提供了技术资料。     

BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示：建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。     

瘟病毒属3种病毒多聚蛋白酶基因同义密码子偏爱性分析

【目的】分析黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)3种病毒多聚蛋白酶基因密码子的使用特点,初步探讨3种病毒多聚蛋白酶基因的进化及对不同宿主的适应策略。【方法】运用EMBOSS软件的CHIPS和CUSP程序及CodonW在线分子生物学软件,分析CSFV、BVDV和BDV的有效密码子数(ENc),碱基GC含量(Gcall),密码子第1、2、3位GC含量(GC1、GC2、GC3),相对同义密码子使用度(RSCU)及同义密码子第3位的GC含量(GC3s),并对3种病毒多聚蛋白酶基因的ENc进行绘图分析。【结果】CSFV、BVDV、BDV 3种病毒多聚蛋白酶基因的ENc值分别为51.205,51.323和52.580,表明3种病毒多聚蛋白酶基因的密码子偏好程度均较低;上述3种病毒多聚蛋白酶基因的GC含量分别为46.84%,45.99%和45.71%,均不超过50%;除BDV多聚蛋白酶基因同义密码子含量表现为GC1>GC3>GC2外,CSFV和BVDV均表现为GC3>GC1>GC2,且除CSFV的GC3为52.02%外,所有病毒的GC1、GC2、GC3均小于50%,可见3种病毒间的碱基组成(GC含量)及ENc值差异较小。RSCU分析表明,与CSFV偏爱使用G/C结尾的密码子不同,BVDV和BDV更偏爱使用以A结尾的密码子,这可能与病毒对宿主的适应策略有关。ENc绘图分析(Nc-plot)说明,碱基组成对密码子使用模式影响较小。【结论】CSFV、BVDV、BDV 3种病毒多聚蛋白酶基因密码子的偏好性较低,这可能是病毒进化过程中对宿主的一种适应策略。     

5种柏科植物叶绿体基因组密码子偏好性分析

【目的】通过叶绿体基因组密码子偏好性,分析5种柏科植物(秃杉、水杉、杉木、福建柏、日本柳杉)的亲缘关系,筛选出与秃杉亲缘相近者作为异种砧木,为秃杉无性繁殖与规模化生产提供理论参考。【方法】通过NCBI下载并筛选5种柏科植物的蛋白编码序列,使用CUSP、CodonW、SPSS、MAFFT等软件分析密码子偏好性形成模式,并构建聚类树和系统发育树。【结果】5种柏科植物叶绿体密码子的A/T碱基均较多,且第3位以A/T结尾为主;有效密码子数基本高于35,密码子使用偏好性总体较弱;由中性绘图分析、ENC-plot分析、PR2-plot分析可得,密码子偏好性的形成同时受自然选择、碱基突变等多种因素影响,且自然选择是主导因素;通过相对同义密码子分析和最优密码子分析确定AAA、CCA、GCU同时为秃杉、水杉、杉木与福建柏的最优密码子,无以G/C结尾的密码子;秃杉与水杉、杉木、福建柏、日本柳杉共有的最优密码子分别为9、7、11、7个,数量上差异较小;基于相对同义密码子使用度与基于蛋白编码序列构建的进化树结构相似,基于全序列和蛋白编码序列构建的系统进化树均显示秃杉与杉木的亲缘关系最为接近。【结论】叶绿体基因...     

一株白牦牛源牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与序列分析

【目的】本研究旨在对来源于白牦牛的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) GSTZ株的E0基因进行分析,并利用E0基因对GSTZ进行基因分型。【方法】通过提取牛病毒性腹泻病毒(BVDV) RNA,使用RT-PCR技术扩增BVDV E0基因,将其插入到pET-28a中,构建pET-28a-E0原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆,鉴定及测序。IPTG诱导后使用BVDV阳性血清作一抗,经western blot鉴定。根据E0基因的序列进行同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树。利用DNAstar预测E0蛋白的抗原表位。【结果】本研究表达的E0蛋白大小与预期结果相符且该蛋白具有良好的抗原性。通过对E0基因序列的同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树,说明牛病毒性腹泻病毒GSTZ株基因型可能属于牛病毒性腹泻病毒-1a亚型,也可能是其他基因亚型发生较大突变产生变异。通过预测E0蛋白B细胞的抗原表位主要位于:7-12、22-26、62-63、94-97、101-105、115-119、127-128、138-140、185-187、215-219位氨基酸残基; T细胞潜在优势抗原区域主要位于:10-14、19-31、36-43、52-58、77-86、96-98、137-140、148-150、167-191、209-211位氨基酸残基。【结论】E0蛋白具有良好的抗原性,通过对抗原表位预测以及对GSTZ进行基因分型,为后续基因工程疫苗和BVDV检测试剂盒的开发提供了理论依据。     

牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与NS5b基因序列测定

【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。