腐烂病菌的GFP标记及其在梨叶片组织中的侵染和扩展观察

【目的】明确梨腐烂病菌强、弱致病力菌株在梨树叶片组织中的侵染及扩展情况。【方法】利用农杆菌介导的遗传转化(agrobacterium-mediated transformation technique,ATMT)方法对梨腐烂病菌强、弱致病力菌株进行绿色荧光蛋白(green looresent protein,GFP)标记,并筛选出和野生型菌株比较在生长速度、培养特性以及致病力都没有发生显著变化的阳性转化子菌株;利用荧光显微技术观察其在梨树叶片组织中的侵染和扩展,比较强、弱致病力菌株的侵染差异。【结果】强、弱致病力菌株在叶片上侵染存在差异。菌丝主要在叶片的上表皮扩展,菌丝扩展前端的叶片组织颜色发生变化,形成一段变色带,强致病力菌株侵染形成的变色带较弱致病力菌株形成的变色带宽,强致病力菌株菌丝在叶片组织上的分布较稀疏。【结论】梨腐烂病菌菌丝主要在叶片的上表皮组织扩展;强致病力菌株的侵入能力较强,其在叶片上扩展时菌丝分布较稀疏,扩展前端形成的变色带宽。     

茶树炭疽病病原菌鉴定及其致病性分析

从来自12个省份茶区的茶树炭疽病病叶分离病原菌,基于形态学和多基因聚类分析对其进行鉴定,并对不同茶区分离的纯培养物致病性进行测定。结果表明,分离到的57株菌株有明显的形态学差异,根据其在PDA上的菌落形态和分生孢子特征可划分为5种类型。选取21个代表性菌株进行多位点（ITS、TUB2、ACT、CAL、CHS-1和GAPDH）的序列和聚类分析,发现测试菌株均属于胶孢炭疽复合种（Colletotrichum gloeosporioides complex）,包括7株果生炭疽菌（C. fructicola）、8株山茶炭疽菌（C.camelliae）、3株暹罗炭疽菌（C.siamense）和3株隐秘炭疽菌（C.aenigma）,其中山茶炭疽菌和果生炭疽菌在调查茶区的炭疽病叶中分离频率较高。采用刺伤接种法将测试菌株接种于‘舒茶早’离体枝条的叶片,结果显示21个代表性菌株中17株能够侵染‘舒茶早’叶片并使其发病,但不同菌种表现出致病性差异,其中山茶炭疽菌表现出强致病力,同时发现同种病原菌不同菌株间也存在致病力差异。此外,在河南茶区首次发现由果生炭疽菌引起茶树炭疽病。     

我国20个梨品种(种质)对国外梨火疫病菌的抗病性评价

【目的】选取Erwinia amylovora国外菌株及国内梨品种(种质),经室内接种,评价不同菌株的致病力及梨品种的抗病性,为研究梨火疫病防控技术提供技术资料。【方法】对供试的梨品种(种质)枝条采用离体接种、梨幼果半果接种法,比较3个不同来源的国外菌株E.a 0001、E.a 0017、E.a 0055的致病力。通过离体枝条接种强致病力菌株E.a0017,结合实时荧光PCR定量检测病原菌数量,制定梨品种抗病性分级指标,综合评估梨品种的抗病水平。【结果】3个菌株对供试梨品种枝条均具有致病力,对‘库尔勒香梨‘’砀山梨‘’黑酸梨’、杜梨具有强致病力,对‘库尔勒香梨’的致病力最强;综合对梨枝条接种的病情指数均值,其致病力的强弱依次为E.a 0001E.a 0055E.a 0017。E.a 0017菌株对梨幼果的致病力较E.a 0001和E.a 0055强,而E.a 0001和E.a 0055对幼果的致病力相近。供试的20个梨品种(种质)对Erwinia amylovora的抗性水平普遍较低,其中14个品种都不同程度感病(占70%),没有发现高抗品种,2个表现出抗病性和4个具有耐病性的品种均为我国的地方品种。【结论】3个E. amylovora菌株对供试梨品种(种质)均具有强和较强的致病力。供试梨品种(种质)中‘,晋酥‘’绿梨’表现抗病性‘,霍城冬黄梨‘’八月酥‘’库车阿木特‘’棉梨’表现出耐病性,其他均为感病品种。     

我国梨腐烂病病原菌的初步鉴定及序列分析

【目的】为了对我国梨腐烂病病原菌进行初步鉴定和序列分析,【方法】从我国15个省(市)梨产区采集腐烂病样品并观察其田间危害症状,通过组织分离法分离获得168份梨腐烂病菌分离株,从中选取72份进行单孢纯化,共获得79份梨腐烂病菌纯化分离株;观察在PDA、25℃黑暗条件下病原菌菌落形态以及产孢体形态,并对其在梨枝条上产生的分生孢子器徒手切片置显微镜下观察其结构特征和分生孢子形态;采用菌丝块接种法测定梨腐烂病菌在‘翠冠’梨离体枝条上的致病力。对部分菌株rDNA-ITS进行PCR扩增、测序,利用BLAST软件与GenBank数据库进行序列相似性分析,并用MEGA 4.1和邻接法构建系统发育树。【结果】根据梨腐烂病菌各分离株在PDA上的菌落形态特征可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种菌落类型,不同梨腐烂病菌分离株在PDA上产生多种类型的产孢体,不同梨腐烂病菌菌株在离体梨树枝条上的致病力存在差异,我国梨腐烂病菌的rDNA-ITS核苷酸序列一致率为99.98%~100%,与苹果腐烂病菌分别聚在同一亚组的两个分支。【结论】我国梨腐烂病病原菌存在不同的菌落类型,其rDNA-ITS核苷酸序列分析显示均为V.mali var.pyri。     

‘沃柑’果斑病病原菌鉴定及防治药剂筛选

【目的】明确重庆开州和长寿‘沃柑’果园发生果斑病的主要致病菌及其致病力。【方法】对‘沃柑’病果进行组织分离、致病性测试,利用传统形态学鉴定和分子生物学(ITS、TUB2、GPDH及LSU条码)鉴定方法鉴定病原真菌;以菌丝生长速率法进行室内药剂筛选。【结果】明确‘沃柑’果斑病病原菌为小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)。在致病力测试中,WC2菌株对‘大雅柑‘’尤力克柠檬‘’塔罗科血橙’和有核‘沃柑’的叶片、果实和枝条均致病,其中对枝条的致病力最强。室内毒力测定结果显示,18种杀菌剂中仅苯醚甲环唑、肟菌·戊唑醇、戊唑醚菌酯和啶酰菌胺4种杀菌剂对WC2菌株有效,抑制EC_(50)分别为0.24、0.72、1.04和5.28μg·mL~(-1)。【结论】‘沃柑’果斑病的致病菌为小新壳梭孢,对‘沃柑’叶片、果实和枝条同样具有致病力,苯醚甲环唑和肟菌·戊唑醇对其具有明显的抑菌效果。     

来源于产黄青霉病毒科成员的分离物对梨轮纹病菌生长及其致病力的影响

【目的】明确产黄青霉病毒科成员(Botryosphaeria dothidea Chrysovirus 1,BdCV1)对寄主梨轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)菌株生物学性状的影响,证实单独感染BdCV1梨轮纹病菌分离株是弱毒菌株;以期确定BdCV1是否为引起梨轮纹病菌弱致病力的单一因子。【方法】从前期弱致病力复合感染双分体病毒科成员Bd PV1和BdCV1的梨轮纹病菌LW-1中经多代菌丝分离获得的疑似仅单独感染BdCV1分离株(命名为LW-C)为材料;采用dsRNA检测、RTPCR,鉴定LW-C菌株中仅携带BdCV1。采用菌丝块接种于PDA培养基以及3针针刺法接种梨果实,观察其菌落形态以及发病情况,测定菌落生长速度和致病性,明确LW-C生物学特性。将LW-C对无毒菌株Mock进行水平转染,检测其传染后衍生菌株的dsRNA并测定其生物学特性。【结果】证实了LW-C仅感染BdCV1,具有弱毒特性;水平转染结果明确了BdCV1因子对梨轮纹病菌的菌落形态、生长速度有抑制作用,对寄主有弱致病力。【结论】确认了BdCV1是引起梨轮纹病菌致病力衰退的主要因子,为真菌病毒防治果树轮纹病害提供了新颖的生防材料。     

来源于产黄青霉病毒科成员的分离物对梨轮纹病菌生长及其致病力的影响北大核心CSCD

【目的】明确产黄青霉病毒科成员(Botryosphaeria dothidea Chrysovirus 1,BdCV1)对寄主梨轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)菌株生物学性状的影响,证实单独感染BdCV1梨轮纹病菌分离株是弱毒菌株;以期确定BdCV1是否为引起梨轮纹病菌弱致病力的单一因子。【方法】从前期弱致病力复合感染双分体病毒科成员Bd PV1和BdCV1的梨轮纹病菌LW-1中经多代菌丝分离获得的疑似仅单独感染BdCV1分离株(命名为LW-C)为材料;采用dsRNA检测、RTPCR,鉴定LW-C菌株中仅携带BdCV1。采用菌丝块接种于PDA培养基以及3针针刺法接种梨果实,观察其菌落形态以及发病情况,测定菌落生长速度和致病性,明确LW-C生物学特性。将LW-C对无毒菌株Mock进行水平转染,检测其传染后衍生菌株的dsRNA并测定其生物学特性。【结果】证实了LW-C仅感染BdCV1,具有弱毒特性;水平转染结果明确了BdCV1因子对梨轮纹病菌的菌落形态、生长速度有抑制作用,对寄主有弱致病力。【结论】确认了BdCV1是引起梨轮纹病菌致病力衰退的主要因子,为真菌病毒防治果树轮纹病害提供了新颖的生防材料。     

东北地区茄子黄萎病菌致病力分化与ISSR遗传变异分析

为了揭示东北地区茄子黄萎病菌的遗传变异,从东北地区4个省49个县(市)的茄子主产区采集黄萎病菌株,从中分离、鉴定并选取80个单孢菌株,对其培养特性、致病力和ISSR(Inter-simple sequencerepeat)遗传分化进行了研究。菌株培养性状研究表明,在PDA培养基上存在4种不同的培养类型,其中菌核型菌株最多,占供试菌株的56.25%,菌丝型菌株最少,仅占供试菌株的7.5%。通过鉴别寄主接种试验,对供试菌株进行致病力分化测定,明确了东北地区茄子主产区存在黄萎病菌强(Ⅰ型)、中(Ⅱ型)、弱(Ⅲ型)3种致病力类型,分别占供试菌株的26.25%,31.25%和42.50%。特异性引物PCR检测结果显示,在供试菌株中落叶型菌株占31.25%,以中、强致病力菌株为主;非落叶型菌株为68.75%,多为弱致病力类型菌株。ISSR的聚类分析结果表明,东北地区茄子黄萎病菌的遗传分化较小,并且遗传分化与地理来源存在明显的相关性。     

不同来源荔枝胶孢炭疽菌生物学特性研究

为进一步研究从不同地域和寄主组织来源的荔枝胶孢炭疽菌的生物学特征,采用离体果实直接接种法和离体叶片针刺接种法在不同品种的荔枝上对11个菌株的致病性进行了验证,发现菌株的致病性存在较大差异。从中选取致病力差异较大的强致病力菌株0977-19-2和弱致病力菌株09619-1-1进行研究,发现二者在菌丝生长速度、菌落形态和颜色等方面很相似,但二者在分生孢子及分生孢子盘形态方面存在一定差异;强致病力菌株0977-19-2的产孢量约为弱致病力菌株09619-1-1的3.2倍;培养6 h后强致病力菌株0977-19-2的分生孢子萌发率约为弱致病力菌株09619-1-1的3倍;这些差异可能是导致2个菌株致病力不同的部分原因,对研究荔枝胶孢炭疽菌的致病机制差异具有重要意义。     

保护地蔬菜灰霉病菌的菌系分布及致病力分化测定

以山东省寿光市保护地栽培蔬菜上分离的30个灰霉病菌菌株为试材,采用菌落培养性状观察和菌饼活体接种法,研究灰霉病菌的菌系划分及对黄瓜叶片的致病力差异。结果表明:供试菌株划分为菌核型、菌丝型和孢子型3个菌系,不同菌株对黄瓜叶片的致病力分化显著,致病力强弱与寄主植物无显著相关性;强致病力菌株以菌核型为主,菌丝型和孢子型菌株致病力相对较弱。     

杧果蒂腐可可球二孢菌致病力测定及杧果主要品种抗病性评价

【目的】测定杧果蒂腐病可可球二孢(B.theobromae)不同菌株的致病力及评价杧果品种的抗病性,为杧果蒂腐病防治技术的研究奠定基础。【方法】采用室内人工接种的方法,对124个B.theobromae菌株进行致病力测定,并针对11个杧果品种进行抗病初步测定。【结果】B.theobromae菌株之间致病力有较大差异,强致病力菌株占28.23%,中等致病力菌株占66.93%,弱致病力菌株占4.84%。同一品种资源分别接种5个不同菌株,抗病性存在较大差异;但是,通过接种B.theobromae后的平均病情指数进行抗性分级,对多个菌株的抗病性进行综合评价发现,‘象牙’为高感(HS)材料,而其余10份材料均表现为感病(S)。【结论】杧果可可球二孢是引起杧果蒂腐的优势病原菌,强致病力和中等致病力菌株在海南分布广泛;供试11份杧果材料中没有对B.theobromae菌株表现抗病的杧果品种。     

梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究

【目的】示踪梨火疫病菌Erwinia amylovora在库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yu)(简称香梨)枝条组织中侵染定殖和扩展特征，为梨火疫病的有效防治提供依据。【方法】以分离获得梨火疫病强致病力菌株E. a001为材料，采用热激法将携带有绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)质粒phc60-gfp转化E. a001，获得了能发出强烈绿色荧光的标记菌株E. a001-gfp。利用该标记菌株接种香梨枝条，检测、观察其在香梨枝条组织中的侵染定殖和扩展动态。【结果】针刺接种和喷雾接种E. a001-gfp引起枝条发病的最低浓度分别为106cfu·mL^-1和107cfu·mL^-1。相同浓度的病原菌接种，喷雾接种较针刺接种后发病显症时间延迟2～3 d。梨火疫病菌侵染枝条产生的坏死病斑的扩展速率随病原菌浓度提高而升高；病菌在1年生枝条上的生长扩展速度显著快于在2年生枝条内的扩展速度。梨火疫病菌入侵后主要存在于枝条维管系统中，大量分布于皮层薄壁细胞和韧皮部薄壁细胞间隙，少量存在于木质部导管中...     

甘肃省苹果树腐烂病菌Valsa mali培养性状及致病力研究

【目的】明确甘肃省苹果树腐烂病菌(Valsa mali)致病力分化情况。【方法】采用平板培养法和离体枝条接种法对Valsa mali两变种的培养性状和致病力进行了研究。【结果】Valsa mali在PDA上有褐色类群和乳白色类群,褐色类群为Valsa mali var.mali菌株,乳白色类群为Valsa mali var.pyri菌株。Valsa mali var.mali不同菌株之间存在致病力分化,菌株PL-1致病力最强,第7天病斑面积为9.54 cm2,菌株TS-5致病力最弱,第7天时病斑面积为4.7 6cm2。Valsa mali var.pyri不同菌株之间也存在致病力分化,菌株WW-1致病力最强,第7天病斑面积为2.72 cm2,菌株WW-2致病力最弱,第7天病斑面积为1.40 cm2。Valsa mali在不同品种间致病力不同,在‘新红星’致病力强,在‘富士’致病力弱。Valsa mali不但侵染苹果树还可以侵染梨树和桃树,Valsa mali var.pyri菌株在梨树上的致病力强于Valsa mali var.mali。【结论】Valsa mali两变种间致病力差异显著,褐色类群菌株Valsa mali var.mali致病力强于乳白色类群菌株Valsa mali var.pyri,Valsa mali两变种内各菌株之间也存在致病力差异显著。     

基于RNAi和蛋白质组学研究胶孢炭疽菌CgCDC2基因的功能

【目的】CDC2是调控细胞周期的主要因子之一,对植物病原菌的生长发育有着重要作用,但目前还未有胶孢炭疽菌CDC2蛋白生物学功能方面的研究。本试验的目的是获得胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)CgCDC2的RNAi突变体菌株,并分析CgCDC2基因的功能。【方法】利用RNAi技术和PEG介导法获得CgCDC2的RNAi突变体菌株,通过表型分析、TMT蛋白质组学分析和酶活性测定来确定该基因的生物学功能。【结果】通过PCR扩增获得CgCDC2基因,编码一个326个氨基酸的蛋白,其RNAi突变体菌株与野生型相比,生长速率减缓、分生孢子产量显著下降、对H_2O_2敏感性增强,PG、PL蛋白质含量、基因相对表达量和酶活性均显著降低,致病力减弱。【结论】CgCDC2参与调控胶孢炭疽菌的生长,分生孢子产量,氧化应激反应以及PG、PL的酶活性,从而降低病原菌的致病力。     

杧果炭疽菌株对台农1号的致病力分化研究

以台农1号杧叶片为材料,采用离体叶片针刺法,对2005—2013年采自海南、广西、广东、云南、四川以及美国夏威夷、泰国地区的112株杧果炭疽病菌进行致病力测定。结果表明,所有菌株均能引起台农1号叶片致病,采自不同地区、不同部位和不同品种的杧果炭疽菌致病性存在一定的差异。供试菌株中强致病性菌株有30株,占供试菌株总数的26.78%;次强致病性菌株有27株,占24.11%;中致病性菌株有35株,占31.25%;弱致病性菌株有20株,占18.86%。     

山东桃褐腐病病原菌种群鉴定及致病性分析

【目的】明确山东省桃褐腐病病原菌种群结构及其致病力差异，为山东桃褐腐病病原菌的多样性研究及有效防控提供理论依据。【方法】采集烟台、威海、临沂等地桃褐腐病样本，利用形态学鉴定、rDNA-ITS序列分析、欧氏距离非加权组平均法(UPGMA)等技术手段，对桃褐腐病病原菌种类、致病力等进行分析。【结果】采集桃树叶片、果实、枝条褐腐病样品，通过组织分离获得41株桃褐腐病病原菌，这些菌株在菌落形态上存在较大差异，结合rDNA-ITS序列分析，分别鉴定为Monilinia fructicola、Monilia yunnanensis及Monilia polystroma，三者占比分别为80.48%、9.76%、9.76%。桃褐腐病病原菌菌丝生长速率为0.47～1.09 cm·d^-1,UPGMA聚类分析证实，其生长速率可被划分为慢、中、快三大类。采用桃叶片有伤接种菌饼方法，确定桃褐腐病病原菌引起的病斑大小范围为0～2.32 cm,UPGMA聚类分析证实，其致病力可被划分为强、中、弱三类。桃褐腐病病原菌菌丝生长速率及产孢量与致病力相关性分析发现，相关系数r分别为0.297 5、0....     

四种寄主来源的灰葡萄孢对草莓的致病力分化研究初报

 从合肥、蚌埠、长丰、和县等地采集的番茄、辣椒、草莓、葡萄等发病组织上分离鉴定获得23个灰葡萄孢菌株, 采用菌丝块创伤接种法, 分别测定了这些菌株对草莓果实和叶片的致力。结果初步表明, 所有供试菌株接种草莓果实和叶片后均引起发病, 但病斑的平均直径有显著差异, 并在不同草莓品种上表现也有差异, 显示灰葡萄孢菌株间对草莓果实和叶片的致病力存在明显的分化。按照在草莓果实和叶片所致病斑的平均直径大小可将供试菌株划分为致病力较强、中等和较弱3种类型。总体来说, 来自草莓和番茄的菌株对草莓果实和叶片的致病力较强, 来自辣椒的菌株对草莓果实和叶片的致病力较弱, 但来自相同寄主的菌株间致病力也存在差异, 菌株致病力差异与菌株地域来源无明显相关。     

海南白沙和儋州油梨叶部及果实炭疽病菌的鉴定

【目的】明确海南省白沙县和儋州市油梨种植基地的油梨叶片和果实的病原菌种类，为该病害的准确鉴定和田间防治措施的制定提供理论依据。【方法】在海南省白沙县和儋州市的油梨种植基地调查炭疽病的发生情况并采集病叶和病果，通过组织分离法和单孢分离法获得纯化分离株，并对纯化菌株进行致病性测定，结合形态学和分子生物学对所得菌株进行病原菌种类鉴定。【结果】从采自白沙县的14份病叶种分离的得到3株菌株，儋州市的10份病叶中分离获得6株分离物以及自白沙市采集的5份病果中分离出的1株真菌，经致病性测定，菌株HNBSL01、HNDZL02和HNBSF03为致病菌，且均与田间症状一致。根据3种致病菌的菌落、分生孢子和附着胞的形态特征可初步判断引起油梨叶片和果实炭疽病的病原菌均为炭疽菌属（Colletotrichum sp.）；多基因（ITS-ACT-TUB2-CHS-1-GAPHD-HIS3）联合分析构建系统发育树分析结果显示，病原菌HNBSL01与暹罗炭疽菌（C. siamense）的同源性为81%、HNDZL02与果生炭疽菌（C. fructicola）的同源性为100%、HNBSF03与长直孢炭疽菌（C. g...     

烟台地区樱桃茎腐病病原菌、致病性及流行条件

【目的】从田间分离并鉴定樱桃茎腐病病原菌,探究病菌对不同品种樱桃叶片、新梢及木质化枝条的致病性及病害的流行动态和流行条件,为病害的防治及品种选育提供科学依据。【方法】从烟台地区樱桃苗圃分离得到樱桃茎腐病病原菌菌株P1639,进行初步形态学和分子生物学鉴定;通过室内试验测定菌株P1639对5个属和1个属间杂交种共17个樱桃品种的致病性,测定对‘先锋’的叶片、新生枝条和木质化枝条的致病性;连续4 a(年)对樱桃茎腐病的发生情况进行田间调查,分析病害流行动态及流行条件。【结果】从田间分离得到病原菌菌株P1639,通过形态学和分子生物学鉴定樱桃茎腐病的病原菌为烟草疫霉(Phytophthora nicotianae);确定了菌株P1639对‘黑珍珠’‘红灯’‘艳阳’‘先锋’‘明珠’‘拉宾斯’‘萨米脱’‘美早’‘桑提娜’‘晚丰’‘布鲁克斯’11个甜樱桃品种均致病,而对‘大青叶’‘马哈利’‘吉塞拉6号’‘ZY-1’‘东北山樱’和‘樱砧王’6个樱桃砧木品种均不致病;菌株P1639能够侵染‘先锋’樱桃叶片和当年的新生幼嫩枝条,不能侵染木质化枝条;樱桃茎腐病的发生与温度、降雨量、湿度密切相关,在7月多雨的年份容易大发生。【结论】烟台地区樱桃茎腐病的病原菌对欧洲甜樱桃(Prunus avium)具有较强的致病力,而对中国樱桃(P.pseudocerasus)、马哈利樱桃(P.mahaleb)、山樱花(P.serrulata)、欧洲酸樱桃(P.cerasus)4个属及酸樱桃(P.cerasus)和灰毛叶樱桃(P.canescens)的杂交种‘ZY-1’均不致病;该病原菌能够侵染欧洲甜樱桃的叶片和当年生新梢,不能侵染木质化枝条;烟台地区樱桃茎腐病的发生与温度、降雨量、湿度密切相关,大爆发于高温多雨年份的夏季。     

源自不同寄主的灰霉病菌对黄瓜的致病力分化研究

从山东省寿光市各保护地蔬菜种植区采集黄瓜、番茄、豇豆等蔬菜灰霉病样本,分离获得8个灰霉病菌菌株。采用菌饼创伤接种法,分别测定了各供试菌株对黄瓜叶片和果实的致病力。结果表明,所有供试菌株接种黄瓜叶片和果实后均能够引起发病,不同菌株所致病斑的平均直径存在显著差异,说明灰霉病菌菌株间对黄瓜的致病力存在显著分化,不同菌株的致病力分化同菌株的寄主来源无明显相关性。