RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是多种生物体内由双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）介导同源mRNA降解的现象。这种现象广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制，以其高效率、高特异性等特性，较反义核酸、核酶、三链RNA等基因沉默技术显示了独特优势及广泛的应用前景。本文就其发现、分子机制及其应用等方面的研究进行综述。     

几种分子生物学技术在兽医领域中的应用

第四讲核酸的分子杂交技术及其应用１概述核酸的分子杂交（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一,是定性或定量检测特异ＲＮＡ或ＤＮＡ序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起...     

产蛋下降综合征（EDS—76）病毒DNA探针的制备及应用研究

用纯化的产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）病毒（Ｈ９１毒株）悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现了１条分子量较大、背景清晰的核酸带。用Ｂａｍ ＨＩ酶消化产生４个片段，大小分别为１７ｋｂ、１０ｋｂ、４．０ｋｂ和２．０ｋｂ。将其中的２．０ｋｂ片段克隆进ｐＵＣ１８ＤＮＡ载体中，重组质粒ＤＮＡ用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，在ｄｏｔ ｂｌｏｔ中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒（ＭＤ     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3‘端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因（Ｆ基因）ｃＤＮＡ序列，设计并合成了１对引物，以他离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒ＧＰＭＶ／ＱＹ９７－１株的核酸（ＲＮＡ）为模板，用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对其融合蛋白基因３＇端进行扩增，获得了预计的８８４ｂｐ左右的片段。将该片段克隆进ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒载体，获得重组质料Ｔ－ＧＰＭＶＦ３＇，采用限制性内切酶和ＰＣＲ方法对该重组质粒进行鉴定，证明所克隆的     

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株gX基因的克隆及鉴定

以ｐＵＣ１９质粒为载体克隆鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）中国王岗株的ＤＮＡ，构建了鸡传染性喉气管炎病毒ＤＮＡ的ＫｐｎⅠＤＮＡ文库。参考ＩＬＴＶ－ＳＡ２株ｇＸ基因的核酸序列，设计并合成了分别为１２ｂｐ和１３ｂｐ的１对引物。以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法特异性地扩增出０．８４ｋｂ的ＩＬＴＶ－ｇＸ基因片段。以地高辛标记该０．８４ｋｂ的片段为探针，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交从ＩＬＴＶ中国王岗株ＫｐｎⅠＤＮＡ文库中筛选出３个含５．２ｋｂ外源ＩＬＴＶＤＮＡ片段的ｇＸ基因阳性重组子。经酶切分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＰＣＲ检测和该片段部分酶谱分析表明，ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ５．２ｋｂ的ＫｐｎⅠ片段无论是片段大小还是酶切图谱均与ＩＬＴＶ－ＳＡ２株完全相同，而且Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ检测均为ｇＸ阳性，证明其中含有完整的ｇＸ基因     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是多种生物体内由双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）介导同源mRNA降解的现象。这种现象广泛存在于生物界,是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制,以其高效率、高特异性等特性,较反义核酸、核酶、三链RNA等基因沉默技术显示了独特优势及广泛的应用前景。本文就其发现、分子机制及其应用等方面的研究进行综述。     

人肿瘤坏死因子α逆转录病毒表达载体的构建

应用ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒构建了含人肿瘤坏死因子－α　ｃＤＮＡ的过渡性载体ｐＢＴ１和ｐＢＴ２。用限制性内切酶ＢａｍＨＩ与ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＴ１ＤＮＡ，分离出了ＴＮＦ－α　ｃＤＮＡ基因片段，并在其平末端加入了ＢａｍＨＩ接头。进而将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＴＮＦ－αｃＤＮＡ克隆到了逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１５′－端长末端重复序列（ＬＴＲ）下游的ＢａｍＨＩ切点上，构建了重组质粒ｐＺＩＰＴＮＦ。该重组质粒经琼脂糖凝胶电泳，限制性内切酶消化和核酸杂交鉴定分析，证明ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１中插入了ＴＮＦ－α　ｃＤＮＡ，并且方向正确。本研究为应用重组逆转录病毒介导ＴＮＦ－α基因转移与治疗奠定了基础。     

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA探针的制备及应用研究

用纯化的产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）病毒（Ｈ９１毒株）悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量较大、背景清晰的核酸带。用ＢａｍＨＩ酶消化产生４个片段，大小分别为１７ｋｂ、１０ｋｂ、４．０ｋｂ和２．０ｋｂ。将其中的２．０ｋｂ片段克隆进ｐＵＣ１８ＤＮＡ载体中，重组质粒ＤＮＡ用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，在ｄｏｔｂｌｏｔ中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＤＮＡ、鸡传染性贫血病毒（ＣＡＶ）ＤＮＡ、ＳＰＦ鸡基因组ＤＮＡ等核酸反应，只与３株ＥＤＳ病毒（ＥＤＳ标准毒株ＡＶ－１２７、ＥＤＳＨ９１毒株和从健康鹅体中分离的ＥＤＳＹ８１毒株）ＤＮＡ呈阳性反应。人工感染产蛋母鸡和雏鸡后２４ｈ即可用该探针从泄殖腔棉拭子样品中检测出ＥＤＳ病毒ＤＮＡ，在感染后３５ｈ仍能从部分感染鸡样品中检出。对部分探针检测阳性鸡的泄殖腔棉拭子样品用ＳＰＦ鸡胚分离病毒，并用ＨＡ和ＨＩ试验检测分离病毒的特异性；在感染过程中，同时检测了血清中ＨＩ抗体的消长情况。结果表明，人工感染鸡排毒至少可以维持２个月左右，而且血清中ＨＩ抗体即使很高，也不能阻止感染鸡的排毒。     

兽医生物工程技术发展的回顾与展望

兽医生物工程技术发展的回顾与展望彭万强（广东省农科院兽医研究所广州５１０６４０）被视为当今世界三大技术革命之一的生物工程技术的问世，标志着人类已从分子水平上认识遗传物质进而发展到能在分子水平上操纵遗传物质。通过基因工程（又称遗传或ＤＮＡ体外重组）将能...     

基因修变生物面临的问题及前景

自从数万年前人类开始种植作物和驯养畜禽以来 ,作物及畜禽的基因修变工作就一直在进行。根据孟德尔的遗传学理论 ,通过杂交和选择 ,人类已培育成数千种高产作物品种和上百种优良动物品种。 80多年来 ,人类在化学、物理学和生化学方面的发展 ,进一步增进了人们对生物遗传基础———核酸的了解。在确定了脱氧核糖核酸 (ＤＮＡ)的结构 ,掌握了ＤＮＡ的复制、分离、合成 ,实现了在试管中的重组以及最终成功地将其再次导入生物活体以后 ,一项全新技术诞生了 ,这就是基因工程技术。借助基因工程技术 ,人们可以培育作物和动物新品种、研究新食品、…     

应用核酸杂交技术检测畜禽衣原体病的研究

从纯化山羊流产衣原体颗粒提取ＤＮＡ，用ＤＮＡ限制性内切酶切割，进行酶切图谱分析，与文献报道的图谱对比，证实确系纯的衣原体ＤＮＡ制品。将衣原体ＤＮＡ用光敏生物素标记，制成核酸探针，用斑点杂交法检测衣原体核酸，灵敏度可达１０ｐｇ。又用重组克隆技术将衣原体ＤＮＡ片段克隆于大肠杆菌质粒载体上，筛选出衣原体特异的ＤＮＡ片段制成光生物素探针，可以同样有交效地检测衣原体核酸。用光生物素衣原体探针检测了山羊、绵羊、豚鼠、小白鼠、鸡胚等的衣原体感染病料，结果准确。与间接血凝法检测衣原体感染做了对比试验，证明核酸杂交法检测衣原体病更为灵敏和特异     

家禽基因转移研究进展

家禽基因转移研究进展朱庆，郑华（四川农业大学动科院家禽科学系６２５０１４）所谓基因转移是对ＤＮＡ的基因进行体外操作，把不同来源的基因按人们的要求重组成一个新的融合基因，导入细胞中，产生具有新的遗传特性的生物。自Ｈａｍｍｅｒ等１９８５年首次获得转基因猪...     

核酸的体外扩增技术

核酸的体外扩增技术济南军区医学研究所刘瑞田传统的分子克隆技术，包括目的基因的提纯、重组ＤＮＡ的构建及重组ＤＮＡ的转化扩增等。此技术操作相当复杂繁锁且耗时很长。在传染病诊断方面，人们虽然对核酸探针检测技术作了大量研究，但在临床实验中普及这种方法却受到不...     

番鸭细小病毒ＭＤＰＶ—Ｑ株ＶＰ２蛋白基因的克隆与序列测定

根据genebank中番鸭细小病毒（ＭＤＰＶ）的基因序列，设计了一种引物ＬＨＭＰ７／ＬＨＭＰ８，同时在这２条引物中分别加入２种限制性核酸内切酶SacⅡ和KpnⅠ的酶切位点，使扩增后的ＤＮＡ片段的两端，分别含有这２种酶的酶切位点。应用ＰＣＲ技术扩增了ＭＤＰＶ－株的ＶＰ２蛋白基因片段。将扩增后的ＶＰ２蛋白基因重组到pMD18-T质粒载体上，并插入片段进行序列测定，测定结果表明，我国分离的ＭＤＰＶ－Ｑ株基ＶＰ２蛋白基因序列与国外分离株的同源性达９７．９％。     

我国兽用转基因微生物产品的安全评价

转基因生物是指通过基因操作技术对遗传物质（DNA）进行重组、修饰,从而改变基因组构成的动物、植物、微生物。动物用转基因微生物产品主要是指经过人工修饰基因的疫苗、诊断试剂和饲料添加微生物。转基因技术打破了异种微生物之间天然杂交的屏障,实现了微生物间的基因转移,获得了新的生物学性状。基因重组技术为人类有效的利用微生物的遗传特性,     

伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建

用限制性核酸内切酶ＮｃｏＩ消化含有伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｆａ侏ＢａｍＨＩ－７片段的质粒ＰＰＢ７，以低融点琼脂糖回收目的片段，经连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｄ，获得缺失３ｇＩ和部分ｇｐ６３基因的重组质粒ＰＰＢ７－１。将ＰＲＶ Ｆａ与ＰＰＢ７－１ ＤＮＡ共同转染ＰＫ１５单层细胞，待出现５０％以上细胞病变时收获病毒，并以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为ＰＦＤＩ／Ｄ６３。小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定     

鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd⁺的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

鹅传染性法氏囊病的剖检与诊治

传染性法氏囊病毒是基因内含有两个片段的双链核糖核酸，这类的排列方式是可以进行遗传重组与抗原结构的变化，导致新的血清型或原始血清型变异株的发生。传染性法氏囊病也是属于双核糖核酸病毒科，鸡患此病较多，且鹅也会发现传染性法氏囊病毒。因此针对鹅患传染性法氏囊病毒的诊治，我们具体分析如下。     

提高核酸疫苗免疫效率的途径

基因免疫是９０年代初开始发展起来的新方法。１９９０年Ｗｏｌｆｆ等试图用注射方法促使小鼠的肌细胞吸收质粒ＤＮＡ以产生新的蛋白质。设置的对照组在注射ＤＮＡ时未加任何化学佐剂，出人意料的是对照组动物的肌细胞吸收了这种裸露的质粒ＤＮＡ后，能高水平地表达外源蛋白［１］。进一步研究表明，直接给动物接种编码抗原的基因片段可使该动物获得对该抗原的免疫力，即将编码某种蛋白的外源基因直接导入动物细胞可达到免疫接种的目的。所接种的核酸（ＤＮＡ以质粒形式或ＲＮＡ以ｍＲＮＡ形式）既是载体，又是抗原的来源，具有疫苗的功能，…     

应用复合引物扩增大肠杆菌肠毒素基因的研究

以两对合成的不同寡核苷酸引物通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、扩增肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）不耐热肠毒素（ＬＴ）和耐热肠毒素（ＳＴ）基因；两对引物从ＥＴＥＣＬＴ和ＳＴ基因中分别扩增出３１４ｂｐ，２３７ｂｐ的ＤＮＡ片段，均能与相应的ＬＴ和ＳＴ基因探针杂交。ＬＴ扩增产物（３１４ｂｐ）和ＳＴ扩增产物（２３７ｂｐ）分别和ＳｍａⅠ和ＨｉｎｃⅡ酶切后，产生１９０ｂｐ和１２４ｂｐ，１４７ｂｐ和９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。同一扩增反应中应用ＬＴ和ＳＴ复合引物进行扩增，３种基因型ＬＴ、ＳＴ和ＬＴＳＴＥＴＥＣ从样品中鉴定出。１０９份动物腹泻粪样分别用ＰＣＲ，核酸杂交和ＥＬＩＳＡ进行测定，结果表明，ＰＣＲ是最为灵敏和快速的测定ＥＴＥＣ的方法。