鸡胚原始生殖细胞生物学特性鉴定及相关基因表达研究

采用酶消化法分离鸡胚原始生殖细胞(PGCs),纯化后进行体外培养,传至5～6代时,通过对阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫荧光标记、碱性磷酸酶检测等方法联合鉴定其基本生物学特性,同时以RT-PCR方法检测其特异基因的表达。结果表明:体外培养的PGCs维持未分化状态,碱性磷酸酶阳性、免疫荧光检测其特异标志物SSEA-1阳性。鸡胚PGCs表达减数分裂前标志基因Dazl、Nanog和GDF3,生殖细胞分化后期基因CVH,原始生殖细胞标志基因Blimp-1以及干细胞多能性相关基因Oct-4,不表达减数分裂启动基因Stra8。提示所获得的鸡胚PGCs,其生物学特性稳定,表达相关特异基因,为鸡胚PGCs的体外培养及鉴定提供理论依据。     

第28期鸡胚原始生殖细胞的分离培养

[目的]进一步优化生殖细胞（PGCs）细胞体外培养条件。[方法]从第28期（5．5d）鸡胚生殖嵴分离PGCs,将PGCs与性腺基质细胞共培养进行原代培养,比较2种培养温度和3种培养浓度对PGCs原代培养的影响,以及2种饲养层细胞对PGCs传代培养的影响,并通过倒置显微镜下形态学观察、碱性磷酸酶（AKP）和过碘酸希夫反应（PAS）染色方法鉴定PGCs。[结果]培养浓度为2．5×10^5个／ml和培养温度为37℃时PGCs增殖较多,不易分化,存活能力较强,以第2代鸡胚成纤维细胞作饲养层时传代培养效果较好,获得了PGCs增殖的未分化集落,为后期的细胞标记及移植研究提供了较多数量和较高活力的PGCs。[结论]获得了PGCs原代与传代培养较好的培芥体系,为禽类EG细胞系的建立和转基因研究奠定了基础。     

鸡胚PGCs迁移与性腺发育关系的研究

采用连续切片法进行鸡胚胎显微观察，研究鸡原始生殖细胞（PGCs）迁移特性及其与性腺发生、发育的关系。结果表明：（1）在孵化53－56h时鸡胚PGCs到达未来性腺形成区域（体腔上皮），且在PGCs到达之前，这一区域已开始增厚；孵化53－56h时，体腔上皮的脏壁层发现有PGCs，说明生殖嵴的发生亦在此期。（2）PGCs最终迁移至增厚的体腔上皮，部分体腔上皮的增厚区域趋向中肾，说明中肾和生殖的发生均有体腔上皮增厚活动的参与。（3）孵化前5d，PGCs仍保持典型特性；卵化7d后，PGCs细胞质中的糖原完全消失。（4）PGCs刚进入未来生殖腺形成区域时呈无序排列，孵化6d时大多数从中紧侧向外移动，排列于未来性腺的上皮层，此时性腺已具有雌雄分化的特征。     

鸡WDR5基因真核表达载体构建及对PGCs形成相关基因表达的影响

【目的】对鸡色氨酸天冬氨酸重复域5（WD repeat domain 5，WDR5）进行生物信息学分析，构建真核表达载体，并检测其对原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）形成相关基因表达的影响，探索WDR5在鸡PGCs形成中的调控作用。【方法】利用ProtParam、 NCBI保守结构域分析、Uniport、TMHMM Server v.2.0和SignalP在线网站，分析WDR5的氨基酸序列、保守结构域、亲疏水性、跨膜结构域和信号肽表达。利用SWISS-MODEL进行同源建模预测其三级结构，借助String网站进行互作蛋白的预测。构建重组载体pcDNA3.1-WDR5-GST，进行双酶切和测序鉴定；将重组载体pcDNA3.1-WDR5-GST转染PGCs，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot检验WDR5重组蛋白在PGC中的表达情况；用RT-qPCR检测过表达WDR5对PGCs形成相关基因(DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14)表达水平的影响。【结果】WDR5蛋白含有1个高度保守的WD40结构域，内含7个典型的WD40重复序列；其亲水性高、不含跨膜结构域、无信号肽表达，可用于构建重组真核表达载体。同源建模和互作蛋白预测显示WDR5高度保守，互作蛋白为类ASH2蛋白（ASH2 Like，ASH2L）、RB结合蛋白5（RB Binding Protein 5，RBBP5）、DPY30和KAT8调控因子NSL复合物亚基3（KAT8 Regulatory NSL Complex Subunit 3，KANSL3）。双酶切和测序结果表明，重组载体pcDNA3.1-WDR5-GST构建成功。RT-qPCR结果显示PGC中重组载体可使WDR5过量表达;Western blot结果表明，PGC中可表达重组蛋白。WDR5过表达可使PGCs形成相关基因的表达水平升高。【结论】构建的WDR5重组载体在鸡PGCs中能够表达；WDR5基因表达上调后，PGCs形成相关基因表达水平升高，推测其可调控鸡PGCs的形成。     

鸡原生殖细胞(PGCs)的提纯及其超低温保存

利用密度梯度离心从孵化51～56h的鸡胚血液中提纯PGCs,通过形态鉴别和过碘酸－希夫试剂染色方法判定提纯的PGCs的纯度在80％左右。将提取到的PGCs放入到含有10％二甲基亚砜的TCM－199中,在液氮中进行保存。将超低温冷冻保存了1个月、6个月和12个月的PGCs（各3管）分别复苏后,用台盼蓝染色,通过红细胞计数板计数鉴定冷冻保存了不同时间的PGCs的平均存活率分别为91．7％、92．6％和91．9％。结果表明所采用的冷冻保存的方法是可行的。所采用的超低温冷冻保存方法简单易行,为今后以PGCs为目的细胞进行超低温冷冻,而后制作种系嵌合体进行保种的研究提供有利的实践基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述

综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用。在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造对水稻育种具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年来研究发现的一种定点基因组编辑新工具,仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变,因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。     

鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率

【目的】针对禽类干细胞研究中,存在转染效率与干涉效率低下的问题,通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中Piwi基因的干涉效果,探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术,分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF）与生殖脊,其中CEF作为PGCs细胞的饲养层,生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞,并通过形态学、化学方法（PAS糖原染色、AKP 活性检测）和免疫学方法（TERT抗体、SSEA-1抗体）对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的mRNA序列（NM_001098852）,利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth siRNAs,并将通用无义序列BLOCK-iT^TM Alexa Fluor® Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照siRNA。同时,在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,将其插入线性化空载体 pRNA-U6.1,构建不同的shRNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的siRNA和shRNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义siRNA以及仅带有GFP荧光标记基因的shRNA载体作为阴性对照,检测siRNA和shRNA转染效率,确定最佳转染条件。其次,将试验组siRNA和shRNA在优化条件下转染PGCs细胞,分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞,提取各个时间段的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因mRNA表达水平,并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后,确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与siRNA或shRNA载体量的配比,得出siRNA转染最优条件为siRNA﹕LipofectamineTM 2000=50 pmol﹕2 μL; shRNA转染最优条件为shRNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5 μL。在以上最优转染条件下,将试验组siRNA和shRNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在siRNA干涉组中,阴性siRNA组和空白组相比,Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显著（P＞0.05）;而3个试验组siRNA与阴性对照组相比,在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显著下降（P＜0.05）,但在144 h时表达差异不显著（P＞0.05）。在shRNA干涉组中,空白组和阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显著（P＞0.05）;而3个试验组与阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上均显著下降（P＜0.05）。与siRNA干涉试验组相比,shRNA 载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】siRNA与shRNA均能较好抑制目的基因的mRNA表达,不同干涉效果表明采用shRNA 载体具有更好及更长时间的抑制作用,这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。     

应用基于重组慢病毒的CRISPR/Cas9技术构建基因突变的鸡DF1细胞

为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否可以用于鸡细胞的基因编辑。扩增sgRNA靶向序列1 220 bp片段,经T7E1酶切琼脂糖凝胶分析可见约300 bp和900 bp大小的条带,表明感染sgRNA慢病毒的细胞mavs产生了突变。序列测定结果表明sgRNA靶向序列发生了多个碱基缺失的突变。以上结果表明基于慢病毒系统的CRISPR/Cas9技术可对鸡基因组进行编辑。     

第28期鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存与体外培养研究

利用Ficoll密度梯度离心,提取鸡胚第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),用不同的冷冻保护液,对PGCs采用分离后直接冷冻保存和体外培养24h后冷冻保存2种方法,以筛选合适的冷冻保护体系。结果发现,分离提纯后直接进行冷冻保存的PGCs,存活率最高为(87.07±1.29)%;体外培养24h后进行冷冻的PGCs,存活率最高为(44.08±1.19)%。对复苏后的PGCs进行体外培养结果发现,分离提纯后直接进行冷冻的PGCs,在体外培养过程中具有形成细胞克隆的能力,且可传代和进行体外分化;而体外培养24h后进行冷冻的PGCs,复苏后在体外培养过程中不能形成细胞克隆,且在体外培养40h左右死亡。     

鸡胚胎原始生殖细胞转染EGFP基因的研究

于鸡胚19期分离生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),用于体外培养和传代扩增;对其第2代PGCs进行组织化学法鉴定,采用3种转染方法以增强型绿色荧光蛋白转染PGCs,并对电穿孔方法转染条件进行优化,荧光显微镜下计数细胞,分析PGCs转染效率,探讨有效的转染方法及其优化条件。结果表明:电穿孔方法可获得较高的转染效率,其最优化条件:电场强度为280 V,时间常数为60μs,质粒浓度为15μg.mL-1,转染后室温静置10 min。     

鸡原始生殖细胞迁移和聚集规律的研究

研究表明 :鸡的原始生殖细胞 ( PGCs)起源于孵化前胚盘的明区 ,而后逐渐迁移至胚体的头前侧部的生殖新月区 ,并于孵化约 2 2 h时 ,大量聚集于此 ( 3 1～ 3 8个 )。随着鸡胚内、外血管的发育 ,PGCs则进入血管中 ,并顺着血管于孵化约 3 6h ( 1 0期 )时首次迁移到胚体上。孵化至 4 4～ 52 h ( 1 1～ 1 3期 )时聚集 (约 1 0 5个 )于胚体的心脏、大血管及头部间充质中。最后 ,PGCs于孵化 62 h( 1 7期 )时大量迁移至胚体后端生殖嵴处 ,迁移过程一直可持续到孵育第 4天。孵化 5d时 ,迁移入生殖嵴的 PGCs与生殖嵴一起共同组成了未分化的性腺     

白消安消减鹅胚内源性原始生殖细胞

降低胚胎内源性原始生殖细胞是提高禽类生殖嵌合体效率的最有效途径,本试验首次研究白消安对鹅胚内源性原始生殖细胞的消减作用。将白消安乳化剂直接注射到鹅种蛋的卵黄内,待鹅胚发育到第8 d时分离生殖腺中的PGCs,并统计PGCs数目。结果显示,糖原染色与免疫荧光染色充分证明从鹅胚生殖腺中成功分离到PGCs;较低浓度(每1颗卵注射150μg)的白消安能显著降低鹅胚内源性原始生殖细胞,从对照的单胚约1 200个PGCs降低到处理组的80个左右。鹅相对于鸡而言对白消安更敏感,较低浓度即可显著降低鹅内源性PGCs。     

织锦巴非蛤形态性状对体质量的影响

猪在农业和医学领域均具有重要应用价值,利用基因修饰技术能够快速提高猪的经济性状和培育 人类疾病动物模型。CRISPR/Cas9 基因编辑技术具有操作简单、高效和低成本的优势,在猪基因修饰领域具有重 要应用。但 CRISPR/Cas9 易引发基因组结构不稳、大范围染色体重排和基因脱靶等问题,因而具有潜在的生物 安全风险。近年基于 CRISPR/Cas9 开发的碱基编辑技术可以实现单个碱基定向转换,不会导致 DNA 双链断裂, 理论上不会引发插入 / 缺失（Indels）,对基因编辑更精准、更安全。随着碱基编辑工具的不断开发和改良,其 不仅能产生 C → T（A → G）突变,还能产生 C、A 两种碱基的同时突变以及 C → G 突变,增加了应用范围;改 良的碱基编辑工具在保持编辑效率的同时能够降低甚至消除旁侧突变、非 C → T（A → G）突变以及 Indels,使 得碱基编辑技术在猪遗传修饰上具有更加重要的潜在应用价值。综述了不同的碱基编辑系统原理、碱基编辑技 术在基因修饰猪模型构建和猪遗传改良中的应用,以及碱基编辑系统在猪成纤维细胞中的编辑效率和脱靶情况, 以期为开展猪碱基编辑应用实践提供参考。     

全球基因编辑育种创新价值链现状与启示

为明晰我国农作物基因编辑育种创新链的角色地位，从技术创新价值链视角出发，从知识原理、应用技术和产品开发3个维度系统梳理分析了全球基因编辑育种创新链的演化逻辑和最新发展态势。结果表明:1)全球大多数研发资源主要集中在中间环节的应用技术开发和种质资源创制上，处在创新链末端的商业化运用产品相对较少，尤其在我国还没有商业化的基因编辑品种面世。2)对基因编辑的进一步原理性知识创新的空间十分有限。基因编辑作为一种普及的技术手段，未来创新的重点在于利用基因编辑工具创制具有新功能的育种材料和种质资源。3)商业化产品开发目前是基因编辑创新链中最薄弱的环节，且只有开发出能满足市场需求，具有重大社会经济效益的基因编辑成果才有意义。本研究进一步提出了我国建立高效运转的基因编辑农作物育种创新体系和准确定位发展目标的对策建议，为构建具有中国特色的创新价值链提供决策参考。     

鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌合体的制备研究

探索了 12～ 17期鸡胚血液中的原始生殖细胞 (PGCs)迁移数量变化规律 ,将其在液氮中冷冻保存。并以Fi coll密度梯度离心、MiniMACS磁气分离、滤膜 3种方法对PGCs进行分离 ,结果发现 ,12～ 17期血液中均有PGCs存在 ,13期达到高峰 (4 7 1± 10 5 )个·μL-1,在血液中比例为 0 0 12 6 %。冷冻保存 3个月后解冻成活率达 80 %以上。3种分离方法所得的分离效果分别为 95 7%、39 2 %、6 3 0 % ;纯度为 2 7 5 %、8 4%、3 1%。将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至 14～ 15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌合体 ,获得 8只雏鸭 (8/ 110 )。以鸡W特异性DNA探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞 ,嵌合率达 84 2 % (16 / 19)。表明鸡原始生殖细胞能够迁移定居到鸭胚性腺中 ,并有可能增殖分化成有功能的配子     

基因编辑CRISPR/Cas9技术在农业领域的应用

CRISPR/Cas9系统通过靶向突变对植物基因组进行编辑,是研究基因功能和作物改良的第三代基因编辑工具。本文介绍了CRISPR/Cas9打靶系统基本结构、工作原理,并展示了其在作物基因功能研究和品质改良中的应用前景。     

鸡 CVH启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体的构建及鉴定

探索建立一种用绿色荧光蛋白对鸡原始生殖细胞进行标记分离的方法.克隆并测序鸡原始生殖细胞特异表达基因cvh1.6kb启动子序列.序列分析表明它含有类似于TATAbox和CAATbox的元件,在其远端上游区域还有多个GC富含区.将cvh基因启动子亚克隆到绿色荧光蛋白表达栽pegfp-1的多克隆位点,成功构建表达栽体pcvh-egfp.重组质粒在脂质体Lipofectamine<''TM>2000介导下分别转染鸡X期胚盘细胞和鸡胚成纤维细胞,并于转染后12h在荧光显微镜下观察转染效果.实验结果显示:在胚盘细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大;在鸡胚成纤维细胞未检测到gfp表达.实验结果说明,由cvh基因启动子控制下的gfp可在X期胚盘细胞特异表达,为利用流式分离技术PGCs标记分离、纯化研究奠定基础.     

虹鳟(Salmo gairdneri Richardson)原生殖细胞的光镜和电镜研究

本文应用光镜和电镜研究了虹鳟(Salmo gairdneri Richardson)原生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)的细胞学和超微结构特征、起源、迁移和数量变动。结果表明:1)虹鳟PGCs的鉴别特征是细胞体较大、细胞界限清楚,核较大,核仁明显,核膜外或线粒体丛间含有生殖致密体(Germinal Densc Bodies,GDBs);2)PGCs起源于原肠晚期的预定中胚层;3)PGCs向生殖腺原基的迁移是随着胚胎的形态发生运动而进行的被动过程;4)迁移期PGCs的数量为70～90个。研究发现,虹鳟PGCs中的GDBs常位于核膜孔附近,推测它可能来自核质。对虹鳟PGCs的鉴别标准、起源和迁移方式作了讨论。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物病原真菌中的应用研究进展

CRISPR/Cas9是在细菌、古细菌基因组中含有的一种成簇有规律的间隔短回文重复序列,该结构被其用于抵御外来微生物基因入侵。通过对上述结构进行改装从而形成一种基因编辑方法,与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术具有更高效的优势。本文以CRISPR/Cas9系统的组成、作用机制和运用原理为切入点,系统总结了该技术在植物病原真菌(稻瘟病菌、橡胶树胶孢炭疽菌、玉米黑粉病菌等)中的致病相关基因组定点编辑应用情况,明确了当前在植物病原真菌中应用CRISPR/Cas9系统的编辑效率整体较低,不同sgRNA设计工具、目的等对编辑效率、靶向特异性的潜在影响,以及宏观突变检验方式的偏差问题等局限性,并提出了该系统应用范围的扩大、编辑效率的提高以及新型编辑方式的挖掘等建议与展望。