柑橘黄龙病PCR检测技术研究

以柑橘黄龙病病原亚洲菌系β-操纵子的特异引物fA2/rJ5进行PCR扩增,依据是否有目标DNA片段的产生来检测柑橘黄龙病菌的存在与否。该检测技术,具有快速、简便、灵敏等特点,可用于柑橘黄龙病的早期诊断,对控制该病害的传播具有重要意义。     

柑橘黄龙病研究进展

柑橘黄龙病是1种系统性侵染的毁灭性病害.近年来,柑橘黄龙病在我国部分柑橘产区为害加重,巳成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一.为了进一步了解该病的发生、发展规律,制定科学、有效的防治技术方案,为农业生产服务,对该病的发生与为害状况、症状表现、防治技术等方面的研究成果进行了概述.     

不同柑橘品种对柑橘黄龙病抗性试验

通过对芸香科12个柑橘品种人为嫁接携带柑橘黄龙病的接穗,观察接种后苗木的症状表现,测试不同柑橘品种对柑橘黄龙病的抗性和耐病性。结果表明,胡柚、金柑、佛手较为抗病,椪柑、瓯柑等较易感病。     

柑橘黄龙病病原研究进展

本文对柑橘黄龙病(HLB)的发现、认识过程及病原菌的分类、检测鉴定技术进行了综述。HLB是一种十分严重的柑橘病害,主要通过木虱和嫁接进行传播,在不同的地区和国家具有不同的名字,已统一命名为HLB。对引起HLB的原因探索经历了一个漫长的过程,从水害、缺素、镰刀菌、病毒到类菌原体,最后确定为细菌。该病原属于α-亚纲,韧皮部杆菌属,分为亚洲种、非洲种和美洲种3个种,可以通过PCR技术进行检测鉴定。同时,对韧皮杆菌的人工培养以及与黄龙病相关植原体的最新研究进展进行了阐述。     

柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用

柑橘黄龙病是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害,在我国大部分柑橘产区发生,严重制约了我国柑橘产业的发展。本文根据黄龙病病原物亚洲韧皮杆菌核糖体16SrRNA基因设计了1对PCR引物HLBF468/HLBR877,并以此为基础建立了常规PCR反应体系,确定了检测体系的特异性和灵敏度。结果表明该体系的检测灵敏度比先前报道的常规PCR方法有了明显提高。利用建立的PCR体系完成了对广东和广西两省区果园柑橘黄龙病的抽样检测。本研究建立的常规PCR方法可以作为一种简便、准确、灵敏的检测技术应用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

柑橘黄龙病PCR检测引物比较研究

柑橘黄龙病潜伏期长、尚无可用于大田的有效治疗药剂,快速、准确的早期检测是防控柑橘黄龙病的关键。PCR检测是目前柑橘黄龙病最常用的早期检测方法。为提高柑橘黄龙病PCR检测的准确性和检出率,本研究依据已测序的黄龙病菌全基因组序列对检测引物OI2c进行了改进（标记为OI2c-gj）,将其与其他常用的7对PCR检测引物进行了特异性和灵敏度的筛选和比较。结果表明,8对黄龙病PCR检测引物中,特异性较好的引物为OI1/OI2c-gj、Las606/LSS、P400F/P400R、A2/J5、16SF/16SR、primer1/primer2;灵敏度较好的引物从高到低依次为：OI1/OI2c-gj=Las606/LSS>P400F/P400R=A2/J5>16SF/16SR>primer1/primer2。综合比较引物特异性和灵敏度,本研究改进的引物OI1/OI2c-gj以及Las606/LSS、P400F/P400R、A2/J5对柑橘黄龙病检测有较好的准确性和检出率,建议用于柑橘黄龙病的早期检测。     

柑橘黄龙病与柑橘木虱在我国发生北界调查

本文介绍了柑橘黄龙病与柑橘木虱发生北界调查方法,根据在浙江、江西、湖南、四川、贵州等地开展的调查,初步明确了国内柑橘黄龙病与柑橘木虱发生北界情况,提出了加强疫情监测、抓好木虱防治、挖除病树和严格种苗监管等柑橘黄龙病检疫控制措施。     

基于近红外技术柑橘黄龙病田间快速检测方法研究

柑橘黄龙病在感病植株和健康植株之间传播速度快,因此快速检测柑橘黄龙病对其防治十分关键。本文研究了近红外技术快速检测柑橘黄龙病的方法。采用PLS-LDA建立的模型对未参与建模的样品进行了检测,结果表明,该模型检测的准确率与普通PCR检测的结果符合率达到100%,假阳性率小于1%。该技术具有检测周期短、无污染等优点,可用于田间黄龙病的快速检测。     

柑橘黄龙病病原DNA微量提取方法比较

对比分析了3种黄龙病病原DNA微量提取方法,方法1和方法2分别采用Sandrine等人和Hung等人的黄龙病病原DNA提取方法,但取样量分别由100mg和250mg减少为20mg和10mg;方法3采用周常勇等人的微量核酸提取方法,取样量为10mg.实验结果表明:方法1提取的病原DNA浓度低、杂质多,PCR效果差;方法2提取的病原DNA浓度较高、杂质少,PCR效果好,但提取周期较长,不适合大批量样品的PCR快速检测;方法3提取的病原DNA浓度较高、杂质少,PCR效果好,且提取速度快,适宜大批量样品的PCR快速检测.     

海南省柑橘主产区黄龙病和病毒病的发生危害情况调研初报

柑橘是我国南方重要的水果之一,柑橘黄龙病和柑橘病毒病已经对我国柑橘的安全生产造成了严重威胁。为了解柑橘黄龙病和病毒病对海南柑橘产业的危害情况,本研究通过荧光定量PCR(Quantitative PCR)和反转录PCR(RT-PCR)分别对随机采集自海南柑橘主产区澄迈县3个福橙种植园和琼中县4个绿橙种植园共计109个样品进行了柑橘黄龙病和柑橘5种主要病毒病的检测。结果表明:澄迈县福橙标准化种植示范基地和琼中县营根镇绿橙种植园2个新植橘园的柑橘黄龙病发病较轻,检出率仅为8%和11%,而其他5个橘园的柑橘黄龙病检出率均在75%以上,严重的达100%。除此之外,7个橘园均未检测到柑橘褪绿矮缩病毒;澄迈县和琼中县的衰退病毒病检出率分别在52.9%和77.8%以上,黄脉病毒病在83.3%和90%以上。澄迈县还检测到碎叶病毒病的存在,检出率在38.1%以上,除红湖农场外还存在裂皮病毒病,检出率在11.8%以上。琼中县的绿橙种植园3还存在裂皮病毒病,检出率为43.8%。综上所述,柑橘黄龙病和病毒病已经严重威胁到海南省福橙和绿橙主产区的柑橘生产安全。加强对海南柑橘苗木安全生产的同时,亟需采取有效的田间综合防控措施,以促进海南柑橘产业的健康发展。     

三种分子检测体系的比较及柑橘果园黄龙病监测

为了评价3种PCR分子检测体系对柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,HLB)大田诊断效果,综合比较了常规PCR、巢式PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(SG Ⅰ-qPCR)方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度、特异性和准确度等参数,并用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR监测广西柑橘园疑似HLB样品425个,比较了2种检测体系的阳性检出率。基于CQULA04F/CQULA04R引物对的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的灵敏度可达10 ag/μL;而巢式PCR灵敏度为100 ag/μL,巢式PCR较常规PCR检测灵敏度高104倍。疑似样品的HLB病原SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR检出率分别为46.6%、40.0%。各检测体系的灵敏性、特异性、符合度依次为SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR>巢式PCR>常规PCR。研究表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR可作为果园大规模HLB早期诊断和监测的首选,而在缺乏定量检测仪器时,巢式PCR也可用于HLB的检测,但需注意避免空气污染导致的假阳性。     

三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较

为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)的检测效果, 首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度, 结果发现：3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。运用3种检测方法对广东5个柑橘品种上的189个黄龙病疑似病样进行检测, 结果发现：黄龙病检出率依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。研究表明：常规PCR适合以较低成本大规模检测黄龙病; 实时荧光定量PCR具有最大的检测灵敏度; 巢式PCR检测技术同时具有前两者的一些优点, 但操作较复杂, 适合技术熟练的研究者使用。     

甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测

为了探索甘蔗宿根矮化病快速检测技术,以细菌16S-23S rDNA内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS2为第1轮引物,以甘蔗宿根矮化病菌特异引物Lxx1/Lxx2为第2轮引物,建立甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测技术。巢式PCR能扩增出438 bp的目的条带,其核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国甘蔗宿根矮化病菌分离物核苷酸序列同源率为100%或99.8%;其检测灵敏度为10fg甘蔗宿根矮化病菌基因组DNA,较常规PCR提高100倍;样品检测结果也表明巢式PCR检测灵敏度明显优于常规PCR,可用于+1片嫩叶和心叶等微量病菌样品的检测。     

不同引物对检测柑桔黄龙病菌灵敏度比较

对目前常用的5对引物(fOI1/rOI2c、fOI2/r23S1、fA2/rJ5、fP535/rP535、fP400/rP400)检测柑桔黄龙病菌的灵敏度进行了比较。结果发现,不同引物对的检测灵敏度不同,5对引物检测灵敏度由高到低依次为:fP400/rP400>fP535/rP535>fA2/rJ5>fOI1/rOI2c>fOI2/r23S1;引物对fP400/rP400比广谱引物对fOI2/r23S1的灵敏度高近千倍。半巢式PCR及巢式PCR的检测灵敏度远高于常规PCR,可检测出接近极限浓度10-7ng/μL,二者没有明显的差别。因此,按照不同目的选择合适的检测引物非常重要,特别是当待测样品中的黄龙病菌浓度极低时,应选择高灵敏度的小片段特异性引物对。     

田间柑橘植株不同部位黄龙病菌的PCR检测及发病原因分析

［目的］了解黄龙病菌在柑橘植株不同部位的分布,为深入研究病菌在植株体内的扩散情况奠定基础;明确病害的发生原因为有效防控该病害提供借鉴。［方法］ 调查浙江省台州市柑橘黄龙病（huanglongbing, HLB）的发生情况,通过常规和巢式PCR,检测了发病情形不同的两个果园内柑橘病株不同部位及不同植株中的黄龙病菌,并对其发病原因进行分析。［结果］ 发现一果园内病株的无症状叶片、有症状叶片和枝条中均含有黄龙病菌,而其周围植株不含病菌;另一果园内病株的有症状叶片、枝条、主干和砧木中均含有黄龙病菌,而其周围植株也含菌。［结论］分析认为这两种果园内柑橘植株发病原因不同,一种可能为通过携带黄龙病菌的柑橘木虱所感染,另一种可能为嫁接过程中通过带菌的接穗感染。     

黄龙病对柑橘叶际微生物组的影响

为明确柑橘叶际微生物组对黄龙病发生的响应规律,采用荧光定量PCR技术检测采集柑橘叶片感染黄龙病菌的情况,通过扩增子测序分析法对PCR检测结果为阴性和阳性叶片的微生物群落进行比较,并通过相关性分析和网络分析对黄龙病菌和叶际微生物的相关性进行解析。结果显示,夏季采集的柑橘叶片中黄龙病菌的检出率为7.5%,而到秋季黄龙病菌的检出率上升到32.3%。黄龙病的发生显著改变了柑橘叶际细菌群落的组成和结构,对于细菌类群的丰度也有一定影响;而对叶际真菌群落的组成和结构无显著影响。黄龙病菌与叶际细菌存在普遍的负相关关系,正相关关系相对较少但相关性更强。黄龙病菌可能通过与厌氧棍状菌Anaerotruncus sp.、梭菌Clostridiales sp.、假单胞菌Pseudomonas sp.、鞘脂单胞菌Sphingomonas sp.、毛螺菌Lachnospiraceae sp.和链球菌Streptococcus sp.的负向互作对柑橘叶际整个细菌群落产生负影响。表明黄龙病发生对柑橘叶际真菌和细菌群落的影响规律不同,同时黄龙病菌可能通过与几种主要细菌的负向互作来实现对叶际微生物组的影响。     

甘蔗赤条病菌巢式PCR检测

甘蔗赤条病是由燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae,Aaa)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。为建立Aaa快速、灵敏的检测技术,根据该病菌16S~23S核糖体基因及其转录间隔区ITS分别设计2对特异性引物,建立Aaa巢式PCR检测方法。结果表明,建立的巢式PCR方法对Aaa标准菌株、水稻食酸菌A.oryzae具有特异性,可扩增出454 bp目的条带,对近缘种德氏食酸菌A.delafieldii及其它科属的红色雷夫松氏菌Leifsonia rubra和甘蔗宿根矮化病菌L.xyli subsp.xyli未扩增出任何条带。以感染Aaa的甘蔗叶片总DNA、含ITS靶标片段的质粒DNA标准品及Aaa标准菌液为模板,巢式PCR灵敏度最低检测限分别为10 fg/μL、10拷贝/μL和36 CFU/mL,是常规PCR灵敏度的1 000倍。应用巢式PCR和常规PCR对14份有赤条病症状的田间甘蔗叶片样品进行平行检测,阳性检出率分别为100.0%和28.6%,表明巢式PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。本研究建立的巢式PCR方法适合于田间甘蔗赤条病害的分子检测与鉴定。