猪带绦虫六钩蚴的体外培养

采用12种培养体系培养猪带绦虫六钩蚴，结果发现单层细胞且无气相存在的培养体系效果较好，促使大部分六钩蚴进入了六钩蚴后期发育，且虫体可延长存活至16d。     

猪带绦虫六钩蚴45W基因家族分子克隆

  利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从激活的猪带绦虫六钩蚴克隆到45W基因家族。通过测序及DNAStar软件分析证实，共得到8个A型转录本、3个与A型转录本相应的B型转录本和4个其它B型转录本，以及1个C型转录本，提示45W相关基因可能更多。在本研究中，发现45W-4B非常保守，有望以此为基础研制出有效的抗猪囊尾蚴病的疫苗。在大肠杆菌中以融合蛋白（GST）的形式对经改造的A型转录本（A3）和B型转录本（B2）进行表达，SDS-PAGE证明，A3呈可溶性表达；B2的表达产物主要形成了包涵体，用强变性剂（6M尿素）处理后再经SDS-PAGE，证明B2也得到了高效表达。Western分析结果表明，二者均与囊虫患者血清不反应或反应很弱；B2能与猪抗六钩蚴血清反应，说明B2可能具有免疫反应性，且其抗原表位可能是线性的。从预测的结果看，猪带绦虫45W蛋白可能是跨膜糖蛋白，跨膜区位于C末端，在它的结构中可能还存在FnⅢ组件。同时，A3和B2蛋白结构中还存在Cn-Em重复单元，以及由16～17个氨基酸构成的α-螺旋的结构单元。在45 W蛋白的加工过程中，磷酸化修饰可能是一项重要内容。由此推测，45W蛋白的作用很复杂，可能在调节基因的表达和维持正常的细胞形态等过程中发挥重要的作用。     

脑囊虫病人血清对猪带绦虫六钩蚴活力影响的研究

本试验利用二甲基噻唑二苯基四唑法染色，判定六钩蚴的活力。结果表明，对照组六钩蚴的活力为２７．３％～９８．２％试验组六钩蚴的活力为１４．１％～７０．９％，试验组与对照组之间差异极显著。     

猪带绦虫虫卵及六钩蚴膜超微结构的观察

【目的】观察猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构。【方法】猪带绦虫病患者用槟榔、南瓜籽法驱虫,收集成熟虫卵。次氯酸钠法破壳后,等渗percoll溶液收集六钩蚴,人工肠液激活六钩蚴。扫描电镜和透射电镜观察虫卵和六钩蚴。【结果】猪带绦虫成熟虫卵呈卵圆形,直径约为50-58μm,由胚膜、内胞质层、六钩蚴膜和六钩蚴等几部分组成;发育期猪带绦虫六钩蚴的膜结构由外向内分别是外胞膜残留层、外胞质层(包括不规则较致密的外层和均质透明的内层)、胚膜(包括胚层和内胞质层)和六钩蚴膜,而成熟六钩蚴的膜结构仅六钩蚴膜一层,厚度约为49-51nm。【结论】猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构和缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)及肥胖带状绦虫(T.saginata)的超微结构相似,但膜下层的糖原颗粒外周无包膜。     

猪带绦虫六钩蚴45W-4BX抗原单克隆抗体的制备及鉴定

将纯化的猪带绦虫六钩蚴45W-4BX重组抗原,采用弗氏完全、不完全佐剂乳化和不加佐剂的方式,3次免疫BALB/C小鼠,检测抗体效价呈阳性后,再经尾静脉加强免疫,取其脾细胞和SP2/0细胞融合,经六钩蚴45W-4BX抗原和GST抗原双系统间接ELISA筛选,获得了18株六钩蚴45W-4BX杂交瘤细胞,按有限稀释法对其中的4株进行了5次亚克隆,最终获取了4株分泌稳定的单克隆细胞株,接种小鼠获取相应的腹水,金标试纸条法鉴定其抗体亚类均属于IgG1类,轻链为κ型;对腹水进行了稳定性试验和单抗初步提纯,并对杂交瘤细胞进行了染色体组型的分析,证明所获单抗能满足常规试验的要求.     

表达猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原的重组活载体疫苗株的构建

 【目的】构建表达猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原的重组鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。【方法】克隆并改造TSOL18基因,构建重组质粒pYA3341-TSOL18,电转入鼠伤寒沙门氏菌终宿主菌株X4550,体外鉴定重组菌X4550（pYA3341-TSOL18）表达蛋白的免疫原性、稳定性、生长曲线、安全性和小鼠免疫试验进行评价。【结果】酶切鉴定和基因序列测定证实重组质粒构建成功;尿素-SDS-PAGE检测有目的蛋白条带,Western Blot证实该抗原具有免疫原性;重组菌株在体外营养选择压力下可稳定地携带重组质粒传代繁殖;蛋白的表达对重组菌株的生长基本没有影响;小鼠实验证实重组菌安全可靠,二免后ELISA检测产生抗体。【结论】成功构建了能稳定表达 TSOL18蛋白的可口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550（pYA3341-TSOL18）。     

猪带绦虫TSOL18-SP蛋白的原核表达及其多抗的制备

对TSOL18基因中4个碱基进行定点突变,并截去N端16个氨基酸的信号肽,构建pGEX-TSOL18-SP原核表达载体,IPTG诱导表达后进行产物的SDS-PAGE及Western blot分析;用改造的纯化蛋白免疫家兔后采集血清,经琼脂双扩散试验检测血清抗体效价.结果表明:TSOL18基因改造后长度为345 bp,共有7个碱基发生突变,但氨基酸序列没有改变,与GenBank收录的TSOL18基因核苷酸序列相似性为97%,氨基酸序列相似性为100%.SDS-PAGE及Western blot分析表明:改造的重组菌诱导后可高效表达可溶性目的蛋白,且TSOL18-SP分子量约为38.7 kD,与猪带绦虫六钩蚴阳性血清反应性强;琼脂双扩散法测定免疫兔血清抗体效价为1∶32~64,说明表达的TSOL18-SP蛋白具有较好的免疫原性.     

以包涵体形式表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原的复性与纯化

重组蛋白的复性是基因工程下游研究的难题和重点。本文应用夹心 ELISA 测免疫活性及变性与非变性 SDS-PAGE 测重组抗原单体和非单体的方法来评价不同复性条件.透析法复性,透析液为含2mg·kg~(-1)尿素、80μmol/PEG4000,0.1/0.1mmol·L~(-1)GSH/GSSG 的 pH 8.0的0.05mg·kg~(-1)PB,以静置缓慢透析为佳,上述条件任意缺一或快速透析,免疫活性下降,二聚体或多聚体明显增加;稀释法复性,复性液为上     

猪带绦虫45W基因家族cDNA克隆和序列分析

 根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到重要保护性抗原45W基因B型转录本cDNA,完整开放阅读框(ORF)的大小为459bp。序列同源性分析与比较表明,所获得的9个B型转录本cDNA除TSO45W-4B-1和TSO45W-4B-2与已报道的TSO45W-4B同源外,其余均属于首次报道的4     

猪带绦虫六钩蚴重组蛋白TSOL18与BSA偶连蛋白的制备

应用异型双功能连接剂MBS(间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)将猪带绦虫六钩蚴18ku重组蛋白(TSOL18)和载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)进行连接,制备连接蛋白BSA-TSOL18,用以增强TSOL18的免疫原性.连接蛋白利用快速脱盐柱分离技术进行纯化;纯化后应用醋酸纤维薄膜电泳证明二者的结合情况;并用间接ELISA法检测不同摩尔比连接产物中抗原部分的活性.结果表明:TSOL18与BSA偶连摩尔比为1∶3时连接有效,且对抗原活性影响小,可满足进一步免疫的要求.     

猪带绦虫组织蛋白酶B基因的克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索猪带绦虫组织蛋白酶B基因克隆、原核表达及抗血清制备的方法。[方法]根据从Gene DB获得的猪带绦虫组织蛋白酶B的基因序列设计特异性引物,以猪带绦虫的c DNA为模板,扩增出猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框。将去掉信号肽的部分进行了原核表达,用重组蛋白免疫青紫蓝灰兔,并制备高效价抗血清。[结果]成功克隆了猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框序列,将其命名为Tscp B,长度为1 074 bp,编码357个氨基酸,理论蛋白分子质量约为39.71 ku,具有组织蛋白酶B的特征结构域。采用大肠杆菌原核表达系统对目的蛋白进行大量表达,成功获得了大小约38 ku的猪带绦虫组织蛋白酶B的重组蛋白,此目的蛋白以包涵体的形式存在。Western blotting表明,猪囊尾蚴病阳性血清可以与纯化的重组蛋白发生特异性结合,说明被猪囊尾蚴感染过的猪血清中存在组织蛋白酶B的抗体。[结论]猪带绦虫组织蛋白酶B重组质粒能在大肠杆菌系统中高效表达,且该蛋白具有较高的免疫活性。     

猪CatSperB和CatSperG基因的克隆、表达及生物信息学

【目的】揭示猪CatSperB和CatSperG基因的存在、蛋白的结构特征、进化关系及时空表达特性。【方法】利用电子和分子克隆技术鉴定猪CatSperB和CatSperG基因全长cDNA,并利用定性RT-PCR和荧光定量RT-PCR进行CatSperB和CatSperG基因的时空表达研究。【结果】①分别获得了3 508 bp CatSperB和3 715 bp CatSperG电子转录子,分别包含3 330和3 483 bp开放阅读框,并经TA克隆测序验证,其CDS序列与人、牛、马和狗等的CatSperB和CatSperG基因的序列相似性在80%以上;②CatSperB分子质量为125.79 kD,为稳定蛋白;CatSperG分子质量为133.40 kD,为不稳定蛋白;③CatSperB和CatSperG 都包含 7 个通道蛋白保守的跨膜结构域,CatSperG蛋白C端含一个超螺旋结构,而CatSperB蛋白无明显的超螺旋结构信号;猪CatSperB和CatSperG与牛、狗和马的CatSperB和CatSperG蛋白同源关系较近,与人和小鼠的同源关系较远;④RT-PCR分析表明,CatSperB和CatSperG基因主要在睾丸中表达,但CatSperB在其它组织也有表达信号;⑤CatSperB和CatSperG基因mRNA表达水平在猪性发育的重要阶段,精子发生（60日龄）、初情期（90日龄）和性成熟（150日龄）前后都有显著提高（P＜0.05）。【结论】获得了猪CatSperB和CatSperG基因的cDNA克隆及其一系列生物信息学参数,揭示了CatSperB和CatSperG蛋白含7个保守的跨膜结构域及不同物种间的进化关系,证实CatSperB和CatSperG基因主要在睾丸表达,且其mRNA表达变化与公猪的性发育相一致。     

猪白细胞介素-2基因的克隆与表达

根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。     

金鱼HSC70和HSP40基因克隆及其原核表达

[目的]克隆金鱼热激同源蛋白70(HSC70)和热休克蛋白(HSP40)基因,构建原核表达载体并通过IPTG诱导表达获得目的蛋白,明确HSC70和HSP40蛋白的生物学功能,为揭示金鱼的高温应答机制打下基础.[方法]提取金鱼鳃组织总RNA,利用RT-PCR扩增金鱼HSC70和HSP40基因,将目的基因片段克隆至线性空表达载体pET-32a上构建原核表达载体pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40,转化大肠杆菌Rosetta表达菌株后用IPTG进行诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting检测分析表达获得的融合蛋白.[结果]金鱼HSC70基因CDS序列全长1950 bp,编码650个氨基酸;金鱼HSP40基因CDS序列全长996 bp,编码332个氨基酸.金鱼HSC70氨基酸序列与斑马鱼、人类、家鼠、金线鲃和草鱼的相似度分别为96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%;HSP40氨基酸序列与斑马鱼的完全一致(相似度100.00%),与普通鲤鱼、金线鲃、人类和家鼠的相似度均为94.12%.原核诱导表达获得的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达,其大小约91.5和55.0 kD,均能与Anti-Trx抗体发生特异性反应.[结论]HSC70和HSP40蛋白在鱼类及哺乳动物中高度保守,经原核诱导表达获得的金鱼融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达,且携带有Trx标签,能与Anti-Trx抗体发生特异性反应,可作为互作蛋白用于RNA pull down试验.     

猪淋巴结PKR基因的克隆与体外初步表达

【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段,与预期结果一致;原核表达载体pGEX-PKR和真核表达载体pDsRed1-PKR经双酶切和核酸测序分析,表明载体构建成功;SDS-PAGE检测结果表明,pGEX-PKR重组质粒在大肠杆菌中成功表达;Westernblot检测到pDsRed1-PKR重组质粒在SUVECs中成功表达。【结论】成功克隆了猪淋巴结PKR基因,并在体外初步表达成功。     

猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

 【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象,克隆TAF7基因,分析该基因结构特点,然后利用IMpRH（the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid,法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板）分析该基因在猪染色体上定位信息,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因在成年五指山猪16个不同组织（心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪）的表达谱信息。【结果】克隆得到长1 701 bp的五指山猪TAF7基因序列,其中包括1 050 bp完整CDS（Coding Sequence,编码序列）区域,分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明,猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4（interleukin-4,白细胞介素-4）紧密连锁,LOD（Limit of Detection,检测极限）值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达,其中在睾丸表达量较高,而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子,而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高,二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达,在猪睾丸中表达量较高,证实它调节目的基因转录具有广泛性。     

猪lncRNA TCONS-00035174基因全长克隆及组织表达

[目的]为探明lncRNA TCONS-00035174对猪肉品质影响作用.[方法]PCR、RACE-PCR扩增和序列拼接获得TCONS-00035174基因全长编码序列,用NCBI-BLAST、DNAMAN、CPC、CNCI等生物信息学软件进行序列和分子特征分析;qPCR分析在松辽黑猪和长白猪各组织的表达情况.[结果]lncRNA TCONS-00035174全长为3889 bp,位于chr2:5855637～5859868区间;与雪貂同源性最高;在松辽黑猪的脾脏组织中表达最高,在长白猪中肺脏组织中表达最高,相同组织中,除肾脏外,松辽黑猪的表达均显著高于长白猪.[结论]lncRNA TCONS-00035174可作为猪肉肉质性状机制研究的候选基因,该基因的发掘可以为后续遗传育种提供参考.     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

运输应激猪骨骼肌中热应激蛋白HSP70和HSP90家族的表达

利用Western blot技术，检测长途运输试验猪骨骼肌（背最长肌和臀长肌）中分属于HSP70家族和HSP90家族的4种应激蛋白（HSP70，HSP72，HSP86和HSP90）的表达，所有运输应激猪和对照猪肌肉组织 中均检测到了上述4种HSP，对照猪组织中HSP的表达说明HSP除了在受应激 的细胞内行使生理功能外，还具有独立于应激刺激应答以外的其它作用，6h长途运输后，HSP的表达量明显不同，HSP70和HSP72在肌肉组织中的表达虽然有一定的增加，但统计学分析差异不显（P＞0．05），而HSP86和HSP90在骨髓肌中的表达明显下降，尤以HSP90下降最显（P＜0．01），提示HSP90家族成员与肉品品质相关，可能作为判应激损伤的的指征。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。