南芥菜花叶病毒单克隆抗体的研制及检测应用

将纯化的南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)制剂免疫Balb/c小鼠,末次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了2株稳定分泌ArMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为3F7,4G10。用间接ELISA方法对所获得的2个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定分别为IgA(3F7)、IgG1(4G10)。间接ELISA效价测定结果:3F7为1:106,4G10为1:108。以单克隆抗体为包被抗体、多克隆抗体为检测抗体的TAS-ELISA检测试剂盒能检测感染ArMV的昆诺藜病汁液的灵敏度为1:1600。     

应用RT-Realtime PCR检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒不同分离物外壳蛋白（CP）基因的保守序列,设计合成引物和1条TaqMan荧光探针,建立了ArMV的反转录实时荧光PCR（RT-Realtime PCR）检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增,实现PCR扩增与探针检测同时进行,实验结果表明该方法具有“灵敏、准确、简便、快速”的特点,适合于口岸对南芥菜花叶病毒的快速检测。     

微滴数字RT-PCR检测南芥菜花叶病毒

为建立一种快速、灵敏、特异的定量检测南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus,ARMY)的微滴数字RT-PCR方法,根据ArMV外壳蛋白基因保守序列设计了特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估.结果 表明,该数字RT-PCR检测方法的特异性好,与其他对照病毒均无交叉反应;检测灵敏度可...     

从进境水仙上检测出南芥菜花叶病毒

利用DAS-ELISA对从荷兰进口的6个品种的水仙种球进行检测发现,品种为Recurvus的水仙种球对ArMV的多抗血清呈阳性反应达85%.免疫吸附电镜观察到在感病水仙种球中存在直径约30nm的球状病毒粒子.根据ArMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计引物,RT-PCR能从感病样品中扩增到预期580bp特异条带,序列测定分析表明此条带的序列为ArMV部分CP基因,在系统关系树上与ArMV的其它分离物形成一簇、亲缘关系很近,表明从进境水仙上检测到了ArMV.     

南芥菜花叶病毒（ArMV）

南芥菜花叶病毒（ＡｒＭＶ）张有才，陈宪斌，焦慧燕（佳木斯动植物检疫局１５４００２）在新公布的“中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录”中，南芥茶花叶病毒（Ａｒａｂｉｓｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，异名，ＲａｓｐｂｅｒｒｙｙｅｌｌｏｗｄＷａｒｆ；Ｒ...     

一步RT-PCR检测南芥菜花叶病毒方法的建立

本研究采用Trizol快速提取植物叶片总RNA，通过GeneBank设计特异性引物，并利用一步RT—PCR技术，最终建立了一套比较实用的检测ArMV的方法。该方法对于其它病毒的检测同样具有借鉴意义。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法.同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断.特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致.     

进境百合种球南芥菜花叶病毒的检测及分子鉴定

本研究根据南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)CP基因序列,设计并合成了特异性巢式PCR检测引物,通过第1轮RT-PCR和第2轮PCR扩增得到预期的930bp和260bp的条带,扩增序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在86%～97%的同源性.结果表明百合上分离到的病毒为ArMV,进一步研究也证明巢式PCR灵敏度与普通RT-PCR相比高出了103倍.     

双重DPO-RT-PCR检测南芥菜花叶病毒及菜豆荚斑驳病毒

针对南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)及菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)基因组中特异性较高的序列,分别设计了特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,建立了一种快速检测这两种植物病毒的多重DPO-RT-PCR方法,...     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

菜豆种子中菜豆普通花叶病毒的RT-PCR检测

为研究国家作物种质库中保存菜豆种质携带种传菜豆普通花叶病毒（BCMV）的状况，根据BCMV的印基因序列设计一对特异性引物，从BCMV侵染的菜豆叶片上扩增出与理论大小一致的714bp的片段。在此基础上，应用改进CTAB法从菜豆干种子中提取总RNA并特异性扩增出相同大小的片段。对目的片段进行克隆、测序和序列同源性比较，结果表明，扩增片段的序列与其它BcMV的印基因序列同源性达88％-98％，确证该方法可以从莱豆干种子申直接检测BCMV。利用建立的方法，分别从单粒菜豆种子样本和30粒菜豆种子样本中检测到BCMV，其检测灵敏度较ELISA方法更高。来自河北的紫芸豆单粒种子带毒率高达100％，而在不同地理来源的6份菜豆种质中，4份被检出携带BCMV，表明入库保存的菜豆种质和种子已普遍为BCMV所侵染。     

实时荧光RT-PCR一步法检测南方菜豆花叶病毒

南方菜豆花叶病毒（Southem bean mosaic virus，SBMV）是我国二类检疫性有害生物，以南方菜豆花叶病毒日本分离物（SBMV-J）总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18．T载体上。序列分析结果表明：SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成，编码266个氨基酸，SBMV．J与其它分离物及株系印基因的核苷酸序列同源性为83％-97％，氨基酸序列同源性为86％-97％。由于SBMV各分离物及株系印基因的同源性较低，难于设计出较长的普通PCR引物。通过较短引物设计和TaqMan-MGB探针技术，建立了SBMV的实时荧光RT-PCR一步检测方法。该方法的检测低限是0．16pg，最佳检测总RNA的量是0．16ng。     

温州蜜柑萎缩病毒实时荧光RT-PCR检测

温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus,SDV)属于温州蜜柑萎缩病毒属Sadwavirus,其寄主范围广,可侵染几乎所有的柑桔属及其近缘属的植物。感染SDV的柑桔树矮化,叶片为典型的船形或匙形叶,并造成果实品质和产量下降。SDV引起的温州蜜柑萎缩病最初在日本流行,20世纪80年代随引种传入我国,且随着一些优良品种的推广而逐步扩散。目前对温州蜜柑萎缩病尚无有效     

从荷兰进口植物中检出南芥菜花叶病毒

南芥菜花叶病毒Arabis mosaic virus(ArMV)是豇豆花叶病毒科Comoviridae线虫传多面体病毒属Nepovirus成员,主要分布在荷兰、比利时等欧洲国家和美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、南非、日本,我国尚未有报道。该病毒通常采用血清学和鉴别寄主方法进行检测,但该方法较易出现假阳性,存在检测时间长,准确性和灵敏度较低等问题。近几年发展起来的基因芯片技术已经广泛用于人类病毒如乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、严重急性呼吸系统综合征病毒[1～3]等医学诊断和动物病毒如口蹄疫、禽流感[4]的检测和检疫,而应用基因芯片检测植物病毒实例的报道…     

甘蔗花叶病毒HC-Pro基因原核表达及表达产物抗血清制备

采用RT-PCR方法自甘蔗花叶病毒北京玉米分离物（SCMV-BJ）的基因组中分离出其HC-Pro基因，通过T4DNA聚合酶连接到原核表达载体pET-22b（＋）上，获得的重组子pETHC转化大肠杆菌B121（DE3），用IPTG在37℃进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明，HC-Pro基因在大肠杆菌中获得了高效表达，产生分子量约为52kDa的融合蛋白。将融合蛋白纯化后免疫兔子，获得了特异性的抗血清并提取了抗体IgG。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1／8192。结果表明，该血清可用于SCMV-BJ的检测，并为进一步分析HC-Pro的功能奠定基础。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麦花叶病毒科Bromoviridae黄瓜花叶病毒属Cucumovirus的典型种。该病毒寄主范围广泛，能侵染85科365属1000多种植物。CMV除能单独侵染寄主植物外，还经常与TMV、PVY等复合侵染，给病害的田间调查和防治造成了困难。作者从山东青州的发病烟草植株上分离到了一个CMV青州分离物（命名为CMV-QZ），利用RT-PCR的方法克隆到了其外壳蛋白（coat protein，CP）基因，利用原核表达的CMV CP制备了抗血清，以期为CMV的准确快速检测提供依据。     

进境荷兰郁金香种苗中南芥菜花叶病毒的鉴定

为了防止南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)传入我国,采用血清学、分子生物学、电镜观察及生物学接种等方法对从荷兰进口的郁金香种苗进行了ArMV检测。结果表明:ArMV血清学反应为强阳性;RT-PCR反应扩增出370bp的特异性目标条带;RT-PCR产物与已报道的3个ArMV部分外壳蛋白基因的核苷酸序列同源性为91.00%～93.24%,氨基酸序列同源性为99%～100%;免疫电镜观察到叶片病汁液中含有直径约30nm的球状病毒粒体;该病毒在黄花烟、白肋烟、矮牵牛和昆诺藜等鉴别寄主上引起坏死和褪绿等典型症状,经DAS-ELISA检测,这些接种寄主均呈ArMV血清学阳性反应。故将该病毒鉴定为南芥菜花叶病毒。     

甘蔗花叶病毒CI蛋白在玉米韧皮部细胞中的免疫定位

为探讨甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)CI基因的功能,对CI蛋白进行了免疫定位.利用RT-PCR方法,扩增甘蔗花叶病毒北京株系(SCMV Beijing isolate,SCMV-BJ)CI基因部分片段,将其连接到表达载体pET-28a上,重组质粒pETCIF1导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中.SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CI基因获得了高效表达.将融合蛋白纯化后免疫兔子获得特异性较高的抗血清,利用该抗血清,对健康玉米和受病毒侵染的玉米茎、叶脉和叶片进行免疫金标记,在茎和叶脉韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒.     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物基因组克隆及序列分析

为揭示河北省黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)分类地位及系统进化情况,通过分子克隆测定了来自河北省西瓜产区分离获得的分离物CGMMV-chb的近全基因组序列,分析其基因组结构特征;并依据近全基因组核苷酸序列及外壳蛋白氨基酸序列进行了系统进化关系分析。结果表明,CGMMV-chb近全基因组大小为6 383 nts,Gen Bank登录号为KJ658958,含4个开放阅读框,编码4种蛋白;与Gen Bank库中的其它12个CGMMV分离物的核苷酸相似性为92%~100%,氨基酸相似性为98%~100%。CGMMV-chb与韩国分离物CGMMV-KW基因序列相似性最高,为98%~100%,与以色列分离物CGMMV isolate Ec基因序列相似性最低,为92%~99%;系统进化关系中CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,处于同一亚组的不同分支中,与以色列分离物亲缘关系相对较远。