植物表达载体pGMAR-BADH的构建

将甜菜碱醛脱氢酶基因BADH和植物表达载体pGMAR通过内切酶BamHI和KpnI双酶切,T4连接酶进行连接反应。重组质粒在大肠杆菌菌株DH5α内扩增,提取并纯化质粒。经鉴定,基因BADH已被完整、正确的插入到pGMAR载体中,并成功将BADH插入到载体pGMAR的两个MAR序列之间。     

人源白细胞介素(h-IL2)基因克隆及原核表达的研究

构建人源白介素(h-IL2)基因的表达载体,并尝试在原核细胞中诱导表达,以用于进一步重组蛋白纯化和抗体生产.以h-IL2基因为模板,采用PCR技术扩增h-IL2基因,连接到pMD-18T载体中构建克隆载体,转化到感受态DH5α,提取质粒PCR、双酶切验证连接成功,经DNA测序鉴定基因序列与GenBank数据库收录h-I...     

pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体的构建

将载体pCAMBIA2300-35s-OCS进行改造,增加了酶切位点Sac Ⅰ,之后,PCR扩增编码胆碱脱氢酶(CDH)的基因并用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ将其与改造后的pCAMBIA2300-35s-OCS连接,得到单价植物表达栽体p2300-gz-betA.再通过Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Sac Ⅰ等酶切位点将编码甜菜碱醛脱氧酶(BADH)的基因及其启动子和终止序列连接到栽体p2300-gz-betA上,最终得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体,并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404.betA和BADH是编码甜菜碱合成途径的两个关键酶的基因(CDH和BADH),也是近年来研究较多的耐盐基因,其双价植物表达栽体应用于遗传转化后,有望进一步提高转基因植物的耐盐性.     

布鲁氏菌omp25基因真核表达载体的构建与分析

摘 要: 【目的】 构建表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌并进行验证。 【方法】 对流产布鲁氏菌疫苗株S19外膜蛋白基因omp25设计特异引物进行PCR扩增,连接到pGM-T载体上,获得pGM-T-omp25,进行PCR扩增、酶切、测序鉴定。将质粒pGM-T-omp25与pGBKT7载体进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切,回收DNA片段,并进行连接,构建pGBKT7-omp25后,转化酿酒酵母菌Y187,并进行PCR鉴定、自激活实验和毒性检测。 【结果】 克隆了流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25,PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。 【结论】 成功构建了表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。关键词：流产布鲁氏菌;基因omp25;酿酒酵母Y187;真核表达     

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增.将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810 bp的产物.VP1基因和 pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础.     

富有柿果ACC合成酶基因RNA干扰植物表达载体的构建

分析克隆的柿果ACC合成酶基因的序列,根据其与表达载体pSMAK311上的酶切位点设计2对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增柿果ACC合成酶基因片段。双酶切PCR回收产物以及表达载体,将酶切产物定向连接构建成反义表达载体;在此基础上构建该酶基因的shRNA表达载体,由此转录的mRNA因两端序列反向互补而成发夹式RNA,因此,可应用于RNA干扰研究。将所构建好的载体转化农杆菌EHA101用于后续的遗传转化研究。     

pCAMBIA2300-betA-BADH双价基因植物表达载体的构建

摘要：本实验以载体pCAMBIA2300-35s-OCS为基础通过分子克隆手段,将甜菜碱合成途径的两个关键酶基因,即编码胆碱脱氢酶（CDH）的betA基因和编码甜菜碱醛脱氧酶（BADH）的BADH基因及启动子和终止序列构建在同一植物表达载体上,得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体。并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404,进一步用于双子叶植物的遗传转化。     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。     

片球菌素基因的克隆及表达

从乳酸片球菌中提取质粒DNA作为模板,根据GeneBank公布的细菌素结构基因,设计一对特异性引物,进行PCR扩增片段,将该片段定向克隆到pTA2载体,测序,与发表的基因序列比较,同源性为100%,然后克隆到表达载体Pet-28a,转化到Escherichia coli DH5α,经过卡那霉素平皿筛选,质粒酶切,PCR两步验证,获得阳性重组质粒,并转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳,显示在4 600 Da处出现条带,与已报道的细菌素分子量大小符合.表达产物对单核细胞增多症李氏杆菌有抗菌作用.     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

植物化的猪α-乳清蛋白基因人工合成

根据猪α-乳清蛋白基因cDNA序列设计了多对特异性引物,采用循环PCR方法人工合成了植物化的猪α-乳清蛋白基因编码区(398 bp)并对该PCR产物进行测序.DNA序列测定结果表明,采用循环PCR法扩增的产物是预期的猪α-乳清蛋白基因编码区,该植物化的猪α-乳清蛋白基因编码区可以用于植物转化,为猪α-乳清蛋白基因转基因植物研究和在转基因植物中进行动物基因表达研究奠定了基础.     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体pENTR-sgRNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到pENTR-sgRNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

玉米特异启动子驱动下结核Hsp65与Esat-6融合基因表达载体的构建及鉴定

利用转基因玉米研制新型结核口服疫苗.构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GHLE,并转化农杆菌LBA4404.以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-HLE联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.成功构建了pC1300GHLE质粒,酶切鉴定得到3.3 kb和8.6Kb2条带,测序分析表明克隆的H8p65和Esat6序列与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.成功构建和转化了pCl300GHLE表达载体,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础.     

小鼠FABP4基因启动子驱动红色荧光蛋白载体的构建及在牛体细胞中的表达

小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)的启动子/增强子元件是脂肪组织特异性启动元件,为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果,首先以小鼠肝脏DNA为模板,通过PCR克隆得到5.9 kb的FABP4基因启动子片段,连入p MD19-T载体后进行酶切及测序鉴定,经Eco T 22I酶切去除非核心启动子区后精简为2.3 kb的片段,通过SacⅡ酶切将5.9 kb片段和2.3 kb片段的启动子连入红色荧光蛋白载体p Ds-Red 2-1的多克隆位点,构建为表达质粒p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞,24 h后实时定量PCR检测红色荧光蛋白转录水平。结果表明,克隆得到的5.9 kb小鼠FABP4启动子片段酶切及测序结果正确,与红色荧光蛋白载体相连的载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red酶切结果与预期相符,表达载体构建成功,实时定量PCR结果显示以上2种细胞在转染后24 h红色荧光蛋白均有表达,且p MF2.3-Red的转录水平是p MF5.9-Red的2倍以上。成功构建了小鼠FABP4启动子驱动红色荧光蛋白表达载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,5.9 kb片段和2.3 kb片段均可驱动外源基因在牛体细胞中转录,且2.3 kb片段启动效率高于5.9 kb片段。     

马铃薯StSOD1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与马铃薯超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因StSOD1作用的上游蛋白,构建其酵母双杂交诱饵重组载体。本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StSOD1的基因片段,通过与pMD-T18连接构建克隆载体,经验证构建成功后,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵重组载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过PEG/Li Ac法将诱饵载体pGBKT7-StSOD1与空载体pGBKT7分别转化到酵母AH109感受态细胞中,检测其是否有自激活作用和对酵母菌株的毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了StSOD1基因,成功构建了诱饵重组载体pGBKT7-St SOD1,并且此诱饵载体无自激活活性和对酵母菌株的毒性作用。此研究结果可进一步为筛选与StSOD1互作的蛋白质及功能研究提供科学依据。