传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。     

猪带绦虫45W-4BX和TSOL18的高效表达及免疫效果研究

RT-PCR扩增45W-4B和TSOL18基因,PCR截去45W-4B基因的N端信号肽和C端疏水氨基酸序列形成45W-4BX。将45W-4BX和TSOL18 PCR产物分别亚克隆人pGEX-4T-1,用IPTG诱导表达,取产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化表达产物制成油佐剂疫苗分别免疫家猪,用25000枚猪带绦虫成熟虫卵进行攻击感染,ELISA检测各组的抗体水平,90d后剖检计算各组的减虫率。结果表明,45W-4BX和TSOL18基因在大肠杆菌中分别以可溶性和包涵体形式获得高效表达,并能被囊虫病人血清所识别。重组蛋白免疫猪15d血清抗体即为阳性,30d左右达到峰值。2种重组抗原的减虫率均在88％以上,与囊虫粗抗原免疫效果相当。这为进一步研制基于45W-4BX和TSOL18的猪囊虫重组基因工程疫苗奠定了基础。     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

猪带绦虫六钩蚴45W-4BX的高效表达、纯化及活性分析

截去猪带绦虫六钩蚴45W-4B基因的N端信号肽和C端17个疏水氨基酸序列形成45W-4BX。设计特异性表达引物，PCR扩增目的片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化BId感受态细胞。用酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆，测序证明阅读框是否正确。用IPTG诱导表达，产物进行SDS-PAGE电泳，Western blot分析其活性。包涵体经纯化、透析复性后作为包被抗原检测囊虫猪和囊虫病人血清中的4B抗体。结果表明．截断的4BX（351bp）基因在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为相对分子质量40000的融合蛋白，并能被囊虫病人血清所识别。ELISA检测表明，囊虫病人血清中含有高滴度的4B抗体，所以45W-4BX的表达产物有可能作为候选抗原用于囊虫病的诊断和免疫预防。     

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。     

表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

本研究根据GenBank数据库中的猪圆环病毒2型全基因组序列设计并合成了1对能扩增完整Cap序列的引物,采用PCR扩增猪圆环病毒2型YZ株的Cap基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得阳性质粒pFastBacHTA-Cap;测序后将该质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得含有Cap基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap;最后将获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap转染sf9昆虫细胞并成功拯救了能稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒rBacmid-Cap,该重组病毒的成功拯救为研制猪圆环病毒2型的基因工程亚单位疫苗奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性

用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因（COE基因）,通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体plRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和westernblot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB／c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP—COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。     

猪GM-CSF基因对猪圆环病毒2型DNA疫苗诱导仔猪免疫反应的调节作用

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）能够诱导树突状细胞的成熟和存活，并提高其抗原递呈功能，是非常有潜力的分子佐剂之一。为了探讨猪GM-CSF对猪圆环病毒2型（PCV2）DNA疫苗诱导免疫反应的调节作用，本研究将表达猪GM-CSF和PCV2衣壳蛋白的重组质粒混合物（pcDNA3．1-gm-csf和pcDNA3．1-orf2）及在同一载体上表达PCV2衣壳蛋白与猪GM-CSF的双表达重组质粒（pIRES-orf2／gm-csf），分别接种于7日龄健康仔猪，共肌肉注射3次，每次间隔2周。结果表明猪GM-CSF基因能够明显增强PCV2DNA疫苗诱导的特异性体液免疫反应，提高外周血淋巴细胞（PBLC）对ConA刺激的增殖活性，增强NK细胞的杀伤功能，影响细胞因子IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平。但GM-CSF基因单独表达和与PCV2衣壳蛋白基因在同一载体上表达，对上述4个细胞因子表达的影响有一定差异。     

猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。     

乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建

设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。     

利用家蚕生产慈姑蛋白酶抑制剂

将慈姑蛋白酶抑制剂Ｂ（ＡｒｒｏｗｈｅａｄＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｂ，ＡＩＢ）基因插入转移载体ｐＵＢＭ—４中，得到重组转移载体ｐＵＢＭ（ＡＩＢ）；与Ｂｍ—ＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕细胞，经空斑纯化，得到不含多角体的重组病毒ＢｍＮＰＶ（ＡＩＢ）；感染家蚕幼虫，利用家蚕高效表达了ＡＩＢ，其表达量为１．０×１０５Ｕ／ｍＬ血淋巴，比活为３．２９×１０３Ｕ／ｍｇ。     

猪带绦虫六钩蚴45W-4B重组蛋白的免疫原性研究

目的观察猪带绦虫六钩蚴45W-4B抗原对仔猪的免疫保护作用。方法用IPTG诱导表达融合蛋白GST-45W-4B。用GST柱进行纯化，以Montanide ISA 206为佐剂制成疫苗免疫仔猪。间接ELISA检测仔猪血清抗45W-4B IgG抗体水平，MTT法进行外周血淋巴细胞殖试验。免疫1个月后全部实验组经口攻击感染25000彬头猪带绦虫虫卵，攻虫3个月后剖检，计算减虫率及保护率。结果免疫组注射疫苗的第2周起，抗体为阳性，45W-4B组持续升高至第8周，淋巴细胞增殖明显高于未免疫感染组。用该抗原制备的疫苗获得了95％的减虫率和33％的保护率。结论该抗原对猪囊尾蚴病具有很好的免疫保护作用。     

利用N-端融合(His)_6标签观察家蚕核型多角体病毒泛素蛋白的亚细胞定位

为了给家蚕核型多角体病毒(BmNPV)泛素蛋白(UB)的功能研究提供亚细胞定位信息,利用Red重组系统和BmN-PV的bacmid系统,进行2次同源重组,成功地将(His)6标签编码序列引入到BmNPV泛素基因(ub)起始密码子ATG和第2个密码子CAA之间,使得表达的BmNPV UB的N-端融合(His)6标签。通过对(His)6的免疫荧光分析观察到BmNPV UB在BmN细胞中呈现3种方式的亚细胞定位:均匀地分布于整个细胞;主要分布于细胞核;分布于细胞核,同时在细胞质中出现零星的点分布。BmNPV UB具有多种不同的亚细胞定位方式,提示其功能的多样性。     

利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统

为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统(BmNPV expression system)在重组病毒构建和纯化过程中存在的重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长等缺点,借鉴国外AcNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacm id;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子以及细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmN-PV病毒的构建。     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察

家蚕核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生多角体蛋白,并形成结构致密的超大分子蛋白质晶体,以有效保护内部包埋的病毒粒子,保证子代病毒的传播。借鉴多角体包埋病毒粒子的原理,观察到多角体也能将外源蛋白质固定入多角体内部。利用能形成多角体的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建的含有绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒能在表达、产生正常多角体的同时也表达EGFP蛋白。共聚焦分析表明,该重组病毒感染后形成的多角体能够发射绿色荧光。被包埋的EGFP蛋白放置1个月后仍能检测到绿色荧光,干燥处理30min后仍能检测到荧光。由此说明将多角体与外源基因同时表达,多角体中会包埋外源蛋白,且能较长时间保存外源蛋白的生物活性。这一现象为解决蛋白质长期保存提供了新思路,对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂也有很好的参考意义。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

家蚕核型多角体病毒(陕西株)orf126基因的表达及与几丁质的体外结合实验

为研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf126基因(Bm126)在感染宿主中的作用机制,采用PCR方法从BmNPV陕西株中克隆了切除N端23个氨基酸(预测信号肽序列)的Bm126基因,并将其和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合后在大肠杆菌中进行了表达。利用纯化的BM126重组蛋白与几丁质进行体外结合实验,Western blot分析没有检测到BM126重组蛋白与几丁质结合的复合物,推测原核表达的重组BM126融合蛋白在体外不能与几丁质结合。