猪痘病毒江西株(SWPV-JX01株)的分离鉴定

本试验利用PK15细胞从江西省某猪场疑似猪痘的保育猪皮肤痘痂中分离到1株病毒,该分离毒株在PK15单层细胞上能连续盲传培养,不产生明显的细胞病变,通过PCR扩增猪痘病毒P35基因,扩增序列与猪痘病毒参考株(AF410153.1)P35基因的核苷酸同源性为97.9%,表明该分离病毒为猪痘病毒,并命名为SWPV-JX01。将SWPV-JX01株F5代细胞培养液经肌肉和皮下注射感染兔和小鼠,人工感染80 h后,通过PCR检测不同组织的猪痘病毒P35基因,从兔的肾脏、脾脏、皮肤、心肌、淋巴结均能扩增到P35基因,且扩增序列与SWPV-JX01株同源性为100%。试验结果表明,SWPV-JX01株能在兔体内增殖,但不能在昆明鼠体内增殖。     

猪痘病毒江西株(SWPV-JXO1株)的分离鉴定

本试验利用PK15细胞从江西省某猪场疑似猪痘的保育猪皮肤痘痂中分离到1株病毒,该分离毒株在PK15单层细胞上能连续盲传培养,不产生明显的细胞病变,通过PCR扩增猪痘病毒P35基因,扩增序列与猪痘病毒参考株(AF410153.1)P35基因的核苷酸同源性为97.9％,表明该分离病毒为猪痘病毒,并命名为SWPV-JX01.将SWPV-JX01株F5代细胞培养液经肌肉和皮下注射感染兔和小鼠,人工感染80 h后,通过PCR检测不同组织的猪痘病毒P35基因,从兔的肾脏、脾脏、皮肤、心肌、淋巴结均能扩增到P35基因,且扩增序列与SWPV-JX01株同源性为100％.试验结果表明,SWPV-JX01株能在兔体内增殖,但不能在昆明鼠体内增殖.     

猪痘病毒江西分离株JX08的分离鉴定

采用PK15细胞培养,对江西省某猪场疑似猪痘的病猪皮肤丘疹进行病毒分离,分离到1株猪痘病毒,命名为SWPV JX08,。根据猪痘病毒基因组序列设计了5对引物,对分离毒株进行TK基因、P35基因、P23基因、TK基因上游和下游片段分别进行PCR扩增,扩增片段与GenBank收录的猪痘病毒(AF410153.1)的核苷酸序列的同源性分别为97.5%、98%、98.6%、98.2%和98%。该分离毒株不但能使PK15细胞产生稳定的细胞病变,还能适应非猪源性的Vero细胞,并产生细胞病变;电镜下可见感染的PK15细胞内形成椭圆形或圆形的包涵体,胞浆中有大量椭圆形、砖形的典型猪痘病毒粒子,病毒粒子中央为哑铃状芯髓,病毒粒子大小为(244³40)nm×(164340)nm×(164²63)nm。该毒株皮下或静脉接种25日龄仔猪,感染7263)nm。该毒株皮下或静脉接种25日龄仔猪,感染7¹1d后,表现典型猪痘的症状(皮肤出现丘疹),其血清中可检测到SWPV抗体。     

江西部分地区猪痘病毒PCR检测及P35基因的分析

为了解江西部分地区猪痘病毒(SWPV)的感染及流行情况,从江西省7个地区(市)共36个规模化猪场采集55份疑似猪痘病猪的皮肤痘痂组织,应用PCR方法对其进行猪痘病毒核酸检测,并随机挑选19个PCR产物进行序列测定和P35基因序列分析。结果表明,55份样品中,有44份样品检测为SWPV阳性,阳性率高达80%;所测的19条序列与SWPV参考毒株(登录号:AF410153.1)P35基因核苷酸同源性为96.3%～98.4%,推导的氨基酸同源性为87.5%～88.5%;各序列之间的核苷酸同源性为97.7%～100%,推导的氨基酸序列同源性为98.2%～100%。结果表明江西省部分地区的猪群中存在猪痘病毒感染。     

1株野生斑鸠源禽痘病毒的分离与鉴定

为确定山东大学趵突泉校区内1只皮肤表面有多个明显痘疹的野生斑鸠的病原体,采集该斑鸠的皮肤痘痂,将其研磨液分别接种于鸡胚绒毛尿囊膜和鸡胚成纤维细胞（CEF）及幼仓鼠肾细胞21(BHK-21)中,均出现明显病变,分离到1株病毒,命名为斑鸠痘病毒-2018(TDPV-2018);对其核心基因部分片段进行扩增,得到3条特异性条带;对扩增产物进行测序分析。结果显示,该毒株在进化分型上归属于禽痘病毒的B分支,与来自英国的燕八哥身上所分离的禽痘病毒亲缘关系最近。可以初步判定感染该斑鸠的主要病原体为1株新的禽痘病毒。本研究为禽痘病毒的防控及致病机理的深入研究奠定了理论基础。     

猪痘病毒TK、ORF121、ORF143基因缺失毒株的构建及其生物学特性的测定

为筛选猪痘病毒（SWPV）复制非必需区并测定其缺失株的生物学特性,本研究根据同源重组原理分别针对SWPV的TK（ORF063）、ORF121和ORF143基因设计引物。应用重叠延伸PCR技术拼接同源重组左右臂及EGFP筛选标记表达盒,将拼接片段分别转染到感染SWPV的PK15细胞。利用荧光显微镜观察标记含EGFP的单个蚀斑,筛选获取重组毒株。应用PCR及Western blotting对重组毒株进行鉴定。分别测定各毒株感染PK15细胞的蚀斑大小和皮下接种保育猪致病性。PCR结果表明,目的基因成功整合到相应位点,成功获得重组毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting结果显示,连续传代的重组毒株在PK15细胞上稳定表达外源蛋白。重组毒株在PK15细胞上形成的痘斑均小于亲本毒株,其中ORF121缺失株差异极显著（P<0.01）。各毒株均可导致保育猪痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病变时间短,产生痘斑小,毒力较亲本下降。综上所述,本研究筛选到2个SWPV基因组中可供外源蛋白插入的复制非必需区ORF121和ORF143,为构建SWPV基因工程载体奠定了基础。     

恶性猪痘的诊疗体会

猪痘是由痘病毒科猪痘病毒属猪痘病毒引起的一种主要危害仔猪的急性、热性、接触性传染病。其特征为皮肤和某些部位的粘膜发生痘疹。发病过程中呈现规律病变，典型病例为痘疹，初为丘疹、次变为水疱、后变成脓疱、脓疱干结成痂、痂脱落后痊愈。笔者曾在临床中遇到两例恶性猪痘病，现将诊疗情况小结如下：１发病情况及症状１．１病例１１９９９年６月２６日，我县肖岭村肖某饲养的２头断奶仔猪发病求诊。临诊可见：病猪精神不振，伏卧于潮湿的舍内垫料上，体温分别为３９．５℃和３８．３℃。颈背部，躯干两侧，前肢、后腿上可见多量的脓疱疹…     

两株死胎源猪圆环病毒Ⅱ型的分离与序列分析

将两猪场Ⅱ型猪圆环病毒(PCV2)核酸阳性的流产死胎病料,接种猪肾传代细胞PK15,成功分离到2株PCV2。利用1对PCV2特异性引物,成功扩增出这2株PCV2长约1700bp的全基因组序列,并与其他PCV2毒株序列进行相似性比较。结果表明:2个分离株全基因组长度均为1767bp,核苷酸序列相似性为99.9%;ORF2基因核苷酸相似性为99.85%,所编码的衣壳蛋白氨基酸序列相似性为100%;2个分离株与SD-3等国内分离株核苷酸序列的相似性较高,最高可达99.9%。     

一株猪细小病毒7群的鉴定和分离

猪细小病毒7群(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是2016年首次从美国猪群发现和鉴定的新的猪细小病毒。为弄清我国猪群中是否存在PPV-7,本文用PPV-7特异性的实时荧光定量PCR和常规PCR方法对采集的10份猪流产胎儿和10份保育仔猪病料分别进行检测,结果发现其中1份保育仔猪样品的常规PCR和实时荧光定量PCR检测结果均为阳性,常规PCR扩增出的246 bp特异性条带测序和分子遗传演化时发现,该序列与PPV-7参考毒株KU5637332和KY996757的同源性分别为99.6%和98.0%,表明该样品中含有PPV-7,进一步用PK-15细胞分离病毒,连续传代5次后PK-15细胞都没有出现典型的细胞病变,但其上清液用实时荧光定量PCR方法都可以检测到该病毒。本研究结果证实我国猪群中存在PPV-7的感染,且检测到的PPV-7毒株能在PK15细胞中增殖。     

猪痘病毒TK、ORF121、ORF143基因缺失毒株的构建及其生物学特性的测定

为筛选猪痘病毒(SWPV)复制非必需区并测定其缺失株的生物学特性,本研究根据同源重组原理分别针对SWPV的TK(ORF063)、ORF121和ORF143基因设计引物。应用重叠延伸PCR技术拼接同源重组左右臂及EGFP筛选标记表达盒,将拼接片段分别转染到感染SWPV的PK15细胞。利用荧光显微镜观察标记含EGFP的单个蚀斑,筛选获取重组毒株。应用PCR及Western blotting对重组毒株进行鉴定。分别测定各毒株感染PK15细胞的蚀斑大小和皮下接种保育猪致病性。PCR结果表明,目的基因成功整合到相应位点,成功获得重组毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting结果显示,连续传代的重组毒株在PK15细胞上稳定表达外源蛋白。重组毒株在PK15细胞上形成的痘斑均小于亲本毒株,其中ORF121缺失株差异极显著(P0.01)。各毒株均可导致保育猪痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病变时间短,产生痘斑小,毒力较亲本下降。综上所述,本研究筛选到2个SWPV基因组中可供外源蛋白插入的复制非必需区ORF121和ORF143,为构建SWPV基因工程载体奠定了基础。     

应用复合PCR法检测猪圆环病毒

根据基因库中猪圆环病毒（PCV）的基因序列设计引物，建立复合PCR方法，对2株PK－15细胞进行了PCV检测。结果2株PK－15细胞都可扩增出PCV－1的基因片段，其中1株还扩增到了PCV－2的DNA片段。由此可见，应用设计的引物进行复合PCR快速检测PCV是可行的，这为PCV的检测、分型及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。     

猪细小病毒的分离与鉴定

本试验从福建省某猪场疑似猪细小病毒病死胎的淋巴结、肝脏中分离到1 株病毒。病料接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等细胞病变,猪细小病毒阳性血清能特异性地中和该分离病毒。根据已发表的细小病毒(PPV) VP2基因的序列设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增531 bp DNA片段。测序结果表明,分离株VP2基因与NCBI公布的NADL-2株的同源性高达99.2％,证实分离的病毒株为猪细小病毒。为进一步开展该病毒致病机理、流行病学、诊断研究与疫苗免疫等奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒的分离和鉴定

从广州某猪场采集疑为病毒性腹泻的病猪粪便，除菌处理后接种PK—15传代细胞，采用在接种物和细胞维持波中加入60μg/mL胰蛋白酶的方法，分离到一株野毒。中和试验、动物回归试验和电镜观察结果表明，分离的病毒为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。     

绵羊痘病毒山东流行株的分离鉴定与T4肽基因序列分析

从山东东营疑似绵羊痘病羊的肺脏组织中分离到1株病毒。取疑似绵羊痘病羊组织病料研磨、冻融、离心后分别接种11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜和牛睾丸继代细胞,鸡胚接种部位出现明显的痘斑;牛睾丸细胞出现聚集、变圆等明显的细胞病变。利用1对绵羊痘病毒T4肽基因特异性引物进行了PCR扩增,获得与预期大小一致的约300 bp的片段。将所得序列与GenBank收录的绵羊痘病毒、山羊痘病毒等毒株相关序列进行比较分析。结果表明,该分离株与国外其他绵羊痘病毒株具有较高的同源性,达97.4%～99.3%;与山羊痘病毒株同源性为96.4%。通过试验初步证明所分离的病毒为绵羊痘病毒,并将该毒株命名为绵羊痘病毒DY株。     

鸽痘病毒的分离鉴定及病理组织学观察

为确诊福建省某规模肉鸽养殖场疑似鸽痘疫情,采集病鸽皮肤痘痂组织,经处理后接种11日龄SPF鸡胚,培养7d后观察到鸡胚尿囊膜增厚,出现典型的白色痘斑。组织学观察可见皮肤表皮增生,形成厚的网状结构,上皮细胞呈不同程度的空泡变性,胞浆内有嗜酸性包涵体,呈红色、圆形或椭圆形;肺脏淤血,肺泡破裂及增殖性支气管炎。待检样本进行鸽痘病毒P4b基因PCR检测,得到特异性条带;根据P4b基因核酸序列构建系统发育树,结果显示分离株与来自美国(KC017965)和南非(KJ801920)的2株鸽痘病毒聚在一起,同源性为100%,与企鹅痘病毒、鹌鹑痘病毒和鸡痘病毒的同源性分别为99.6%,99.6%和91.1%;与金丝雀痘病毒和火鸡痘病毒同源性最低,为73.3%～75.0%。结果表明,本次暴发为鸽痘病毒感染所致,为鸽痘防控及致病机理研究奠定了理论基础。     

表达猪圆环2型的多拷贝P28-Cap重组猪痘病毒的构建及表达量分析

为探究猪痘病毒作为载体表达猪圆环病毒2型（PCV2）-Cap蛋白，插入外源基因P28-ORF2的拷贝数与PCV2-Cap蛋白表达量的关系。本试验以猪痘病毒为载体，通过双酶切连接及无缝克隆方法构建重组质粒，并纯化到了8株含不同拷贝数（1~8拷贝） P28-ORF2的重组猪痘病毒，基于荧光斑大小、电镜观察病毒粒子及Western blotting结果进行判断。纯化到的8株重组病毒的荧光斑直径为317.41~384.96 μm，大小无明显差异。重组猪痘病毒粒子形态与亲本病毒一致。Western blotting结果为插入1拷贝P28-ORF2的重组蛋白表达量最低；随着P28-ORF2拷贝数的增加，PCV2-Cap表达量也随之增加；至插入4拷贝P28-ORF2时，PCV2-Cap表达量达到峰值；随后减少。8株重组猪痘病毒荧光斑大小无明显差异，表明猪痘病毒基因组中插入不同拷贝数P28-ORF2对重组病毒在PK15细胞内的增殖无影响。重组猪痘病毒粒子的形态未发生变化说明多拷贝外源基因的插入并未对猪痘病毒的结构造成影响。本研究结果表明，猪痘病毒为载体表达外源蛋白时，单启动子启动多拷贝外源序列能明显提高外源蛋白的表达量，插入4拷贝的外源序列为较合适的拷贝数。     

抗猪传染性胃肠炎病毒杂交瘤细胞构建及单克隆抗体制备

TGEV-PL株在PK15细胞上增殖,经浓缩纯化获得TGEV抗原,建立了间接ELISA检测方法.应用杂交瘤技术获得3株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞.经检测其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤细胞染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,腹水抗体效价达1∶6×104,与6株毒(菌)株的抗原之间无交叉反应.经阻断试验证实,其分泌的McAb能识别抗原是TGEV所特有的抗原决定基.     

猪痘的诊治

猪痘是由猪痘病毒引起的急性传染病,其特征是皮肤或粘膜上发生特殊的丘疹和疱疹。病猪和病愈带毒猪是本病的传染源。病毒随病猪的水疱液、脓汁和痂皮污染周围环境。传染方式主要通过猪血虱或蚊蝇传播媒介传播,也可直接接触传播。1诊断1·1流行特点本病常发生于1~3月龄仔猪(体重     

规模猪场猪蓝耳病免疫抗体水平监测

为了解贵阳市花溪区猪群高致病性蓝耳病病毒免疫水平情况,2014年对花溪区15个规模猪场随机采集958份血样,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对高致病性猪蓝耳病免疫抗体水平进行监测。监测结果表明,15个规模场的958份血清,免疫抗体合格数为798份,合格率为83.30%。结果表明贵阳市花溪区猪蓝耳病抗体免疫状况较为良好,有效地控制了高致病性猪蓝耳病疫隋的发生与流行。     

不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附

为研究不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附作用,本研究采用体外培养的猪气管环检测不同毒力的猪肺炎支原体代表菌株对猪气管上皮细胞及纤毛的损伤情况,初步验证不同猪肺炎支原体代表菌株的毒力.应用间接免疫荧光技术研究不同猪肺炎支原体分离株、标准株、168致弱株及疫苗株对猪肾细胞PK15、肺泡上皮细胞SJPL和猪肺泡巨嗜细胞3D4/31的黏附情况.结果表明猪肺炎支原体野毒株XLW-1能引起猪气管上皮细胞严重病变及纤毛损伤、脱落;国际标准弱毒株J株仅能引起猪气管上皮细胞轻微病变;168疫苗株既不能引起猪气管上皮细胞病变,也不能引起纤毛损伤.野毒株XLW-1、国际标准强毒株232株、弱毒株J株及168疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31,168致弱株可以黏附PK15和SJPL.野毒株、标准强毒株、标准弱毒株、168致弱株及疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31.